[发明专利]基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法

说明书

技术领域

本发明属于转基因检测技术领域，特别涉及一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法。

背景技术

随着现代生物技术的发展，转基因食品已逐步进入普通百姓的生活。由于转基因食品所具有的潜在非安全性，为保护广大消费者的权益，满足其选择权和知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。

目前转基因产品检测方法分为两大类：

1、免疫学检测法

免疫学检测法是从蛋白质水平对转基因食品进行检测，即对外源蛋白质的测定。可将其分为Western杂交、酶联免疫法(ELISA)、试纸条法和快速检测试剂盒法。免疫学检测法，其基本原理是通过抗原(antigen)抗体(antibody)之间的特异反应来实现的。这种方法的不足在于：第一，由于抗原抗体反应的专一性，因此一种试剂盒只针对一特定转基因产物，无法高通量、快速地检测具有多种混合成分的食品样品；第二，加工过的转基因食品中的蛋白质抗原性很容易破坏，从而影响检测结果的准确性；第三，有些转基因食品不表达蛋白质或表达量很低或很大时，则无法进行检测。

2、PCR检测法

PCR检测法是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的，它具有灵敏度较高、特异性强、可准确定量等优点。现阶段常用的PCR技术有：定性PCR，定量竞争PCR和实时荧光定量PCR，PCR-ELISA，巢式扩增PCR(Nested PCR)和复合扩增PCR(Multiplex PCR)。但该项技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果，即检测物质本身含有转基因特制而未被检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成分。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法。该方法设计一条靶基因探针，探针的5’端和3’端能够与目标的检测基因序列互补配对，在完全互补配对的情况下，连接酶把能够完全配对的探针连接成环化的探针，再用一条5’端生物素化复制引物以该环化探针为模板进行滚环扩增，扩增出与环形探针模板互补的串联重复序列的DNA单链；然后将产物与钌标记的探针杂交，最后进行电化学发光检测。只有当探针能够与转基因物种的待测序列完全互补才能被连接酶连接成环化探针，从而能产生用于滚环复制的模板；而不含转基因的物种因为不能产生滚环复制的模板，因此不能得到扩增产物；通过对扩增产物与钌探针杂交后进行电化学发光检测能判断转基因的有无。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，包括以下步骤：

(1)从转基因物种样品中提取样品的基因组DNA即靶基因1。

(2)将靶基因1与过量的靶基因探针2混合，90～95℃变性，然后自然冷却到室温，靶基因1与靶基因探针2退火、杂交。

(3)然后加入2～5个单位(U)DNA连接酶，37℃下进行连接反应20～30分钟，靶基因探针2被DNA连接酶连接成环化探针3。

(4)在上述环化探针3中加入过量的与环化探针3互补的生物素化的复制引物4、10～15个单位(U)DNA聚合酶和1～3毫摩尔dNTPs，在37℃进行滚环扩增复制反应90分钟左右，产生生物素化滚环扩增产物5。

(5)在室温下，步骤(4)得到的生物素化滚环扩增产物5与过量的钌标记的核酸探针6杂交30～60分钟，得到杂交产物。

(6)将上述杂交产物与链霉亲和素包被的磁珠孵育大约20～30分钟，然后用磁分离器分离，去掉上清，收集磁珠吸附的杂交产物于电化学发光仪器样品池中。

(7)往样品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，检测样品池中的三联吡啶钌复合物产生的电化学发光信号确定样品中是否含有转基因产品。比较样品检测的信号与非转基因样品的信号，当样品信号大于非转基因样品信号与三倍标准偏差之和的信号时可判断样品为含有转基因的样品。

所述步骤(1)的靶基因1提取方法如下：对非粉末状的固体样品，采用研磨处理成粉末状，然后提取样品中的DNA。对于液态样品，采用冷冻干燥法干燥并磨碎成粉末状。

所述步骤(1)的转基因物种样品中含有的基因是CAMV 35S启动子、NOS终止子、Km^r(抗卡那霉素基因)、Neo^r(抗新霉素基因)、Kyg^r(抗潮霉素基因)或Bar^r(抗草丁膦基因)的基因，以及人工插入基因组改变物种品质与功能的特异的外源基因。