[发明专利]老年性痴呆重组腺病毒基因疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种老年性痴呆重组腺病毒基因疫苗，为分泌性共表达柔性可折叠的多价Aβ_1-15及基因佐剂的重组腺病毒疫苗，其中，所述Aβ_1-15氨基酸序列为：SEQ ID No.1：Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln采用柔性连接肽连接多价Aβ_1-15。

2.根据权利要求1所述的一种老年性痴呆重组腺病毒基因疫苗，其特征在于所说的柔性连接肽的序列为：

Gly-Gly或Gly-Ser。

3.根据权利要求1或2所述的一种老年性痴呆重组腺病毒基因疫苗，其特征在于所说的Aβ_1-15氨基酸序列为四价，即4×Aβ_1-15。

4.根据权利要求1或2所述的一种老年性痴呆重组腺病毒基因疫苗，其特征在于所说的基因佐剂为人粒-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF。

5.如权利要求1的老年性痴呆重组腺病毒基因疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成多条寡核苷酸引物，通过基因扩增得到的两个或以上含有柔性连接肽基因的二价Aβ_1-15基因片断；

SEQ ID No.2：

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Gly-Gly-

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln，即2×Aβ_1-15；

(2)将两个或以上含有柔性连接肽基因的二价Aβ_1-15基因片断依次克隆入质粒pcDNA3.1，制备重组质粒pcDNA3.1-s4×Aβ_1-15；酶切pcDNA3.1-s4×Aβ_1-15质粒，回收纯化s4×Aβ_1-15片断；

(3)合成多条寡核苷酸引物，PCR扩增出GM-CSF基因片断或白细胞介素-4基因片断、IRES基因片断；

(4)将从重组质粒pcDNA3.1-s4×Aβ₁₅酶切出的4×Aβ₁₅基因片断及(3)中经酶切纯化的基因片断依次克隆入pShuttle-CMV质粒中制备pShuttle-4×Aβ₁₅-IRES-GMCSF重组穿梭载体；

(5)利用pAdEasy系统，同源重组后，在人胚胎肾293A细胞中包装出重组腺病毒Ad-4×Aβ₁₅；

(6)通过氯化铯密度梯度低温超高速离心纯化重组腺病毒Ad-4×Aβ₁₅，并进行滴度测定；

其中pcDNA3.1-s4×Aβ₁₅质粒的构建方法为：

1.1设计插入pcDNA3.1的四价B细胞抗原表位片段4×Aβ₁₅序列

Kozak+signal peptide IgGκ+Aβ_1-15+GG+Aβ_1-15+GS+Aβ_1-15+GG+Aβ_1-15；

1.2Kozak+IgGκsignal peptide+Aβ_1-15+GG+Aβ_1-15+GS，即2×Aβ_15-1片段的引物设计

P1引物：SEQ ID No.3：5’-GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAT TCA GGATAT GAA GTT CAT CAT CAAGAT GCA GAA TTC CGA CAT GATTCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAAGGG-3’；斜体加粗为甘氨酸连接肽，甘氨酸连接肽前后分别为Aβ₁₅碱基序列，加粗为BamH I酶切位点，下划线为引物配对的碱基；

P2引物：SEQ ID No.4：5’-CCCTTG ATG ATG AAC-3’；加粗为BamH I酶切位点，下划线为引物配对的碱基；

P3引物：SEQ ID No.5：5’TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA GGTTCC ACT GGT GAC GAT GCA GAA TCC CGA CAT-3’；下划线为引物配对的碱基；

P-4引物：SEQ ID No.6：5’-GGGAG ACA GACACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG-3’；加粗为KpnI酶切位点，斜体为Kozak序列，下划线为引物配对的碱基；

1.3GS+Aβ_1-15+GG+Aβ_1-15，即2×Aβ_15-2片段的引物设计

P5引物：SEQ ID No.7：5’-GGGGAT GCAGAATTC CGA CATGAT TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAAGAT GCA GAA TTCCGA CAT GAT TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA TGA-3’；斜体加粗为甘氨酸连接肽，甘氨酸连接肽前后分别为Aβ₁₅碱基序列，加粗分别为BamHI和Xho I酶切位点，下划线为引物配对的碱基；

P6引物：SEQ ID No.8：5’-CCGTCA TTG ATG ATG-3’；加粗为Xho I酶切位点，下划线为引物配对的碱基；

1.42×Aβ_15-1片段的扩增

P2，P3为引物，以合成的P1引物为模板，Ex Taq酶，94℃预变性5min，然后94℃变性45s；52℃退火30s；72℃延伸45s，30次循环；最后72℃延伸7min，扩增P2×Aβ_15-1片段；然后，P2×Aβ_15-1片段为模板，P2，P4为引物，相同PCR条件扩增2×Aβ_15-1片段；1.5％的琼脂糖电泳观测扩增结果，PCR产物纯化试剂盒纯化；

1.5 2×Aβ_15-2片段的扩增

P5，P6为引物及模板，Ex Taq酶，94℃预变性5min，然后94℃变性45s；52℃退火30s；72℃延伸45s，30次循环；最后72℃延伸7min，扩增2×Aβ_15-2片段；

1.6pcDNA3.1-4×Aβ₁₅的构建

用Kpn I和BamH I双酶切2×Aβ_15-1片段和pcDNA3.1；回收线状pcDNA3.1载体与2×Aβ_15-1片段，T₄ DNA连接酶，16℃过夜连接，转化感受态E.coli DH5a，挑选转化子，含氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，Omega质粒小量制备Kit提取质粒，用KpnI/BamHI于37℃双酶切鉴定，阳性重组子命名为pcDNA3.1-2×Aβ_15-1；同样，用BamH I和Xho I双酶切2×Aβ_15-2片段和pcDNA3.1-2×Aβ_15-1，以同样的方法获得阳性重组子pcDNA3.1-4×Aβ₁₅；

pShuttle-4×Aβ₁₅-IRES-GMCSF重组穿梭载体的构建方法为：

2.1IRES片断的引物设计

P1引物：SEQ ID No.9：CCGCTCGAGAATTCCGCCCCTCTCCCT；后18个碱基为IRES上的碱基序列，下划线为XhoI酶切位点；

P-2引物：SEQ ID No.10：ACGCGTCGACCATATTATCATCGTGTT；后18个碱基为IRES上的碱基序列，下划线为SalI酶切位点；

2.2hGM-CSF基因片断的引物设计

P3引物：

SEQ ID No.11：

CCGCTCGAGAAGCTTGTCGACCACAACCATGTGGCTGCAGAGCCTG；后18个碱基为hGM-CSF上的碱基序列，下划线分别为XhoI和SalI酶切位点；

P4引物：

SEQ ID No.12：CGGATATCTCACTCCTGGACTGGCTC；后18个碱基为hGM-CSF上的碱基序列，下划线为EcoRV酶切位点；

2.3pShuttle-s4×Aβ₁₅的构建

以KpnI和XhoI双酶切本课题组构建的pcDNA3.1-s4×Aβ₁₅质粒并切胶回收s4×Aβ₁₅片断，同样双酶切纯化pShuttle-CMV载体；连接，转化感受态E.coliDH5a，阳性重组子命名为pShuttle-s4×Aβ₁₅；

2.4pShuttle-s4×Aβ₁₅-GM-CSF的构建

抽取健康人血液，淋巴细胞分离液提取人淋巴细胞培养，ConA刺激72h后提取细胞总RNA，逆转录并以P3和P4为引物PCR扩增hGM-CSF基因片断；XhoI和EcoRV双酶切纯化的hGM-CSF基因片断和pShuttle-s4×Aβ₁₅重组子，连接，转化感受态E.coli DH5a；阳性重组子命名为pShuttle-s4×Aβ₁₅-GMCSF；

2.5pShuttle-s4×Aβ₁₅-IRES-GMCSF重组穿梭质粒的构建

以pShuttle-IRES-hrGFP-1为模板，以P1和P2引物PCR扩增IRES基因片断；XhoI和SalI双酶切纯化的IRES基因片断和pShuttle-s4×Aβ₁₅-GMCSF重组子，连接，转化感受态E.coli DH5a；阳性重组子命名为pShuttle-s4×Aβ₁₅-IRES-GMCSF。

6.根据权利要求5所述的老年性痴呆重组腺病毒基因疫苗的制备方法，其特征在于第一个二价Aβ₁₅基因之前含有Kozak序列及小鼠IgGκ轻链信号肽序列。