[发明专利]老年性痴呆重组腺病毒基因疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗及其制备方法，特别是一种老年性痴呆重组多价β-淀粉样蛋白1-15(Aβ_1-15)腺病毒疫苗及其制备方法。

背景技术

老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)是一种神经细胞退行性疾病，临床以进行性记忆和后天获得的知识丧失为特征，直到最后病人丧失生活能力。随着发病人数的增加，AD给家庭和社会带来沉重的负担，是一个重要的社会和医疗卫生问题。关于AD的治疗，目前尚无理想方法，现有的治疗策略主要着眼于缓解症状，并没有阻止AD的病理进程，其临床疗效并不理想。Aβ是老年性痴呆病理变化老年斑的主要成分，其由39～42个氨基酸组成。近年来的研究表明，Aβ的集聚和沉积及其伴随的神经元损害是老年性痴呆病理机制的中心环节，因此，针对Aβ的治疗策略和方法相继被提出。研究表明，1999年Schenk首次报道{Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathologyin the PDAPP mouse[see comments].Nature，1999 Jul 8；400(6740)：173-7}采用免疫学方法对转基因AD模型鼠(PDAPP鼠)治疗；目前，国外的老年性痴呆疫苗Aβ₄₂肽疫苗已进入IIa临床试验，由于部分试验病人出现了接种后综合症，包括无菌性脑膜炎，实验因此停止。尸检发现，在患者的软脑膜、血管间隙及脑实质内有T细胞浸润，由此推测脑膜脑炎的发生可能与Aβ₄₂全肽C末端含有的毒性T细胞抗原表位(Aβ_16-42)激发了机体Th1型自身免疫反应有关。因此，通过去除AβT细胞抗原表位、保留其B细胞抗原表位的方法来制备第二代AD疫苗的方法成为了首选。

最近文献报道的第二代AD疫苗仍有许多不尽人意的地方：1)研究者们制备的抗原大多为化学合成，合成肽的化学修饰难度大，成本高，而且纯度不高。2)研究者们在制备含有AβN末端B细胞抗原表位的多价疫苗时，大多是将B细胞抗原表位片段直接与一个新的T细胞表位连接，或者B细胞抗原表位直接串联，容易影响抗原的空间结构，不利于Aβ的B细胞抗原表位的暴露。

发明内容

本发明的目的就是为了克服制备老年性痴呆疫苗的上述缺点，提供一种毒性小、免疫原性好、以柔性肽连接AβB细胞抗原表位的一种老年性痴呆重组多价Aβ_1-15腺病毒基因疫苗，本发明的一个实施例为提供重组四价Aβ_1-15腺病毒基因疫苗(Ad-4×Aβ₁₅)。本发明的另一个目的是为了提供成本低、化学纯度高的生产该疫苗的方法。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：合成多条寡核苷酸引物，通过基因扩增得到的两个或以上含有柔性连接肽基因的二价Aβ_1-15基因片断、IRES基因片断(internal ribosome entry site，核糖体内部进入位点)及优选采用GM-CSF基因片断(采取人的GM-CSF即hGM-CSF，粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage-colony stimulating factor)，也可以采用白细胞介素-4，依次克隆入pShuttle-CMV(购自美国stratagene公司的商业质粒)中，同时利用pAdEasy系统(购自美国Qbiogene公司)制备出能呈分泌性共表达柔性可折叠的多价Aβ_1-15及基因佐剂GM-CSF的重组腺病毒疫苗。其中，所述Aβ_1-15氨基酸序列为：

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln(SEQ ID No.1)

柔性连接肽的序列可以为：

Gly-Gly或Gly-Ser

其中，基因佐剂为GM-CSF，它能与多价Aβ_1-15基因呈分泌性表达。柔性连接肽避免了多拷贝AβB细胞抗原表位的空间僵化结构，还使Aβ₁₅表位更容易暴露，增强了免疫原性。同时也增加了免疫原的分子量，降低了降解的可能性。GM-CSF作为基因佐剂有增强体液免疫和细胞免疫的功能。

本发明的老年性痴呆重组多价Aβ_1-15腺病毒基因疫苗的生产方法包括以下步骤：