[发明专利]一种降解纤维素合成乙醇的转基因酿酒酵母菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种能够降解纤维素成为葡萄糖进而合成乙醇的转基因酿酒酵母菌及其构建方法。

背景技术

目前我国车用燃料乙醇几乎都是用粮食玉米等为原料生产，大量生产燃料乙醇势必会带来车与人争粮的问题，直接推动粮食价格的不断上涨，并且会有引发食物短缺的危机。解决方式是尽量由纤维素生产乙醇而避免用淀粉和糖类来生产乙醇。在我国每年玉米秆、小麦秆、稻草、高粱秆有7亿吨的总量，但目前大部分秸秆都是焚烧，造成了环境污染，用这些农林废弃物作为原料来生产燃料乙醇是一个重点的发展方向，这种做法还可以缓解汽车尾气污染，减少温室效应，这也是目前全世界都在攻克的难关。

纤维素(Cellulose)是自然界中存在最广泛的碳水化合物，也是地球上数量最大而且廉价的可再生资源。由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，韧性和刚性很强使其不容易降解，首先的难题就是要破坏它的组织结构。用物理方法既无法完全破坏纤维素的结构，又十分耗能，而化学方法虽然可以较完全降解纤维素，但操作复杂、污染严重且不经济。因此，利用低耗能、低污染的生物技术对纤维素进行生物转化一直是研究热点。

纤维素分子是由D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键相联结而成的直链高分子。纤维素酶(Cellulase)是以能水解纤维素的β-1，4-糖苷键从而具有纤维素降解能力的一组酶的总称。一个完整的纤维素酶系，通常由作用方式不同但能相互协同催化水解纤维素的三类酶组成，即：(1)内切β-1，4-葡聚糖酶(Endo β-1，4-glucanase，EC3.2.1.4)，又称内切纤维素酶，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；(2)外切β-1，4-葡聚糖酶(Exo β-1，4-glucanase，EC3.2.1.91)，又称外切纤维素酶，这类酶可以破坏结晶纤维素的结构，使结晶纤维素链开裂，同时可以作用于纤维素链末端，每次切下一个纤维二糖分子；(3)纤维二糖酶(Cellobiase，EC3.2.1.21)，又称β-葡萄糖苷酶，这类酶能将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分类学上属于酵母属(Saccharomyces)，具有利用葡萄糖合成乙醇的能力，它们既具有类似原核生物的生长特性，便于培养和进行遗传操作的优点，又具有典型真核生物的特征，是优秀的一种模式真核生物和模式实验系统，被称为真核生物的“大肠杆菌”。而且由于具有无毒性、易生长的特点，被称为GRAS(generally regarded as safe)生物。1996年酿酒酵母的全基因组测序工作就已完成，酿酒酵母基因组的序列信息为利用酿酒酵母进行基因的转化表达研究提供了丰富的背景信息，人们对其进行控制和遗传改造的研究越来越多。近年来，对各种酿酒酵母菌的菌种遗传改良和基因重组研究在基因工程、代谢工程和酶工程领域都显示出广阔的应用前景。

酿酒酵母是工业上乙醇发酵的首选菌种，具有将葡萄糖转化为乙醇的能力，但其缺乏有效降解纤维素生成葡萄糖的酶，在自然条件下不能直接利用纤维素类物质发酵产生乙醇，若能将纤维素酶系的酶基因导入酿酒酵母，以基因工程手段弥补了酿酒酵母菌纤维素降解能力的缺陷，从而可实现利用农业纤维素废弃物发酵生产燃料乙醇的工业化目的，进而可实现纤维素→葡萄糖→乙醇→燃烧→CO₂→纤维素的生物质能绿色循环利用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种能够同时分泌内切纤维素酶、外切纤维素酶、纤维二糖酶这三种纤维素酶，通过这三种纤维素酶协同作用，从而将纤维素降解成为葡萄糖并进而合成乙醇的转基因酿酒酵母菌。

本发明的另一个目的在于提供上述转基因酿酒酵母菌的构建方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一种酿酒酵母多基因表达载体，该表达载体是将酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶启动子和磷酸甘油激酶终止子三个表达元件插入到大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体中，并在磷酸甘油激酶启动子上游和磷酸甘油激酶终止子下游设计有同尾酶的酶切位点，即得酿酒酵母多基因表达载体。

上述酿酒酵母基因组rDNA1.8kb片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述磷酸甘油激酶启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述磷酸甘油激酶终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。