[发明专利]采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法

权利要求书

1.一种采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法，依次包括以下的步骤：

I、高分子真皮支架的制备与修饰

1)PHBV支架制备：

(a)将3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸共聚物PHBV溶于氯仿中制成浓度为120-130g/L的 溶液，然后每升溶液加入930-950g的氯化钠为致孔剂，充分混匀，得到浓浆液；

(b)将浓浆液倒入孔径为0.8～1.0cm圆形金属模具中，待氯仿溶剂挥发70-80％后，从 模具中取出成形支架，再置于通风橱内室温48-54小时晾干，25℃-35℃温度下，1000～1300Pa 真空范围内干燥2小时～3小时除去残余溶剂；

(c)将成形支架浸入去离子水中，每隔6-8小时换水1次，48-52小时内换水6-8次直 至将致孔剂滤除干净，室温晾干，25℃-35℃温度下，1000～1300Pa真空范围内干燥24-48小 时制成PHBV多孔三维支架；

(d)将PHBV多孔三维支架以无水乙醇浸泡1-2h，用波长254nm、36W的紫外线正反 面各照射1.5-2h，无菌PBS漂洗3-4次，每次20-30min，无菌条件下自然晾干；

2)制备胶原-甲壳糖-硫酸软骨素-透明质酸修饰液：

按质量比例为14～16∶2～4∶1∶1制备原料I型胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、 透明质酸A；在36W紫外灯照射下，用0.1％乙酸搅拌溶解I型胶原然后加入脱乙酰甲壳糖， 待脱乙酰甲壳糖完全溶解后，再以15-30滴/分的流速加入预先溶解好的6-硫酸软骨素和透明 质酸A溶液，继续搅拌溶解3小时；使胶原、脱乙酰甲壳糖、6-硫酸软骨素、透明质酸A 最终浓度分别为7-8mg/ml、1-2mg/ml、0.5mg/ml和0.5mg/ml；然后在冰浴条件下加入0.5ml 10×DMEM培养液，用1mol/L的NaOH快速调pH至7.2-7.3；

3)修饰PHBV支架：

将2)步制备的复合胶原修饰液均匀涂布于1)步制备的PHBV多孔三维支架表面，室 温条件下静置20-30min，以此面为真皮面，在PHBV多孔三维支架的另一面，用浓度为0.4％ 的人源IV型胶原蛋白浸泡20-30min，此面为表皮面；

II、制备表皮干细胞

1)羊膜分泌液的制备

先制备羊膜片：无菌条件下，取足月妊娠剖腹产的羊膜，钝性分离除去绒毛膜，用含 100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素的PBS冲洗干净血污，再转移到DMEM液中；然后在无 菌环境下，按6孔培养板或12孔培养板孔径的大小将人羊膜剪成圆形或半圆的羊膜片，再 将羊膜上皮面向上铺布于6孔板或12孔板的孔底；最后加入无白血病抑制因子LIF的胚胎 干细胞培养液，收集羊膜分泌液备用；

2)从人皮肤原代分离培养制备表皮干细胞

将外科手术环切下的幼儿新鲜包皮用含100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素的0.1mol/L 的PBS缓冲液彻底清洗2次；然后在无菌条件下去除皮下脂肪和结缔组织，将包皮剪切成约 2.0mm×3.0mm的皮片；用质量浓度0.25％的裂解酶Dispases分离表皮和真皮，然后用生理 盐水或D-Hanks液清洗3-5次；

表皮部分用质量浓度0.25％胰酶+0.02％EDTA按1∶1比例混合，4℃消化2±0.5小时， 消化成单细胞悬液，然后接种于铺布有质量浓度为0.4％的IV型胶原包被的培养皿中，置5％ CO₂、37℃培养箱内快速黏附10-15min后，弃去未粘附细胞；将粘附细胞吹打脱离培养壁， 按1×104个/cm²置于第2步1)制备的铺布有人羊膜的培养皿上继续培养，培养基为无LIF 的ES完全培养基；或将细胞接种于用5μg/ml丝裂霉素C处理的小鼠3T3成纤维细胞滋养 层上继续培养，所用培养基为全层皮肤专用培养基；

将第2步2)所述方法制备的表皮干细胞以鼠抗人角蛋白19CK19单克隆抗体和鼠抗人 β1整合素单克隆抗体为一抗，采用免疫细胞化学方法鉴定细胞呈CK19阳性和β1整合素阳 性；

III、制备原代人成纤维细胞：

取外科环切手术获取的包皮组织，以第2步2)所述方法分离皮肤真皮部分，以0.125％ 胰酶消化获取原代培养人皮肤成纤维细胞，然后放入含10％新生牛血清高糖DMEM培养基培 养，每24-36小时半量换液，培养3～4天，待细胞融合80％时，胰酶消化收集细胞，制备以 KSM培养基重悬的成纤维细胞用于全层皮肤制备；

IV、全层皮肤专用培养基制备

取第2步1)收集的人羊膜分泌液，经0.22μm微孔小组膜过滤后，与角质细胞无血清 培养基KSM与按体积比1.5～2∶8～8.5混合，再添加关键促生长因子5×10^-10M霍乱毒素、 10ng/mL人重组表皮生长因子EGF、5μg/mL胰岛素、0.5μg/mL氢化可的松、30μg/mL庆大 霉素、15ng/mL两性霉素、30μg/mL牛垂体提取物、5μg/ml转铁蛋白、1×10^-10M甲状 腺素T3和24.3ug/mL腺嘌呤，培养基中钙终浓度为0.10mM；

V、全层皮肤制备：

将第1步所得的PHBV多孔三维支架置于6孔或12孔培养板上，经复合胶原修饰的真 皮面向上，以最小容量100-200μl接种以人KSM培养基悬浮的原代培养人皮肤成纤维细胞， 细胞密度为1×10⁵cell/cm²-2×10⁵cell/cm²，待4-8小时细胞粘附后，加1.5-2ml足量角 质细胞无血清培养基浸没培养，每36-48小时半量换液，培养5-7天，完成全层皮肤真皮部 分构建；

将PHBV支架反转，在表皮面接种第2步2)制备的人表皮干细胞，接种细胞密度为1× 10⁵cell/cm²-2×10⁵cell/cm²，用第4步制备的全层皮肤专用培养基代替含10％新生牛血清的 H-DMEM培养基，浸没培养72-96小时后，采用气-液界面培养，每48-60小时半量换液，10-14 天后完成全层皮肤制备；

VI、检测

同一批以12孔培养板制备的组织工程皮肤中，取其中一块皮肤固定于以PBS配制的4％ 多聚甲醛溶液中，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚5μm-6μm，苏木素-伊红H.E染色； 显微镜下观察人工皮肤的组织结构：去除皮肤结构不完整、表皮分层不明显或缺少分层、角 质细胞含量较少，真皮层成纤维细胞含量少、胶原排列紊乱者，即得表皮层含基底层、棘层、 颗粒层和角化层等分化结构；真皮层含大量成纤维细胞，与PHBV支架融合性好，胶原纤维 有序列排列；表皮真皮分界明显的组织工程皮肤产品，可用于皮肤毒性检测试验。