[发明专利]采用干细胞筏式培养制备毒性检验用全层皮肤的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用干细胞组织工程技术构建全层替代皮肤的方法，可以用于替代活体动物(或人体)皮肤用于毒理学试验领域。 

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是外源化学因素(化学品、药品、化妆品等)或物理机械因素(紫外线、微波等)毒性作用的主要器官。利用动物或人体皮肤进行皮肤毒性测试是化妆品、药品、食品添加剂及原料、农药、生物制品、化学品健康安全评价的常规检测项目。传统的皮肤安全性评价实验不仅要求一定数量和高质量的实验动物，而且试验周期长，成本高，某些反应会给动物造成极大的痛苦。世界各国非常重视实验动物的福利问题，如上世纪欧洲各国、美国颁布的动物福利法，中国的《实验动物管理条例》等。随着国际动物保护和动物福利运动的兴起，40多年前国外最先提出了以″减少(reduce)″、″替代(replace)″和″优化(refine)″为核心内容的“3R原则”，并在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，不再以动物模式为基础的毒理学系统已被科学家采用，并被许多国家的政府、欧洲和国际法规所接受。2002年11月7日欧洲议会与欧盟理事会在布鲁塞尔达成协议，决定“从2009年3月11日起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏实验”，也“不允许成员国从外国进口和销售进行动物实验的化妆品”。欧盟新化学品法规REACH(化学品的注册、评估、许可和限制)也提出鼓励动物试验替代方法的开发和应用。采用体外构建的组织工程皮肤进行毒性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。 

组织工程化皮肤分为组织型表皮替代物、真皮替代物和器官型全层皮肤替代物几类。1975年，Rheinwald和Green采用3T3成纤维细胞作滋养层，体外培养人自体表 皮细胞获得成功(Rheinwald JG，Green H.Serial cultivation of strains of humanepidermal keratinozytes：the formation of keratinizing colonies from singlecells.Cell.1975，6：331-344)。美国Advanced Tissue Science公司生产的商品名为Dermagraft的人工真皮以高分子材料PGA、PGL网为基础，植入新生儿成纤维细胞后培养成人工真皮替代物，结合自体表皮膜片用于临床移植(Hansbrough JF，Dore C，Hansbrough WB.Clinical trails of a living dermal tissue replacement placedbeneath mesh，split-thickness skin grafts on excised burn wounds.J Burn CareRehabil，1992，13：519-529)。美国Organogenesis公司生产的Testskin人工皮肤模型，其表皮层由人角质细胞分化形成，真皮层由人成纤维细胞种植于I型牛胶原支架构成(Rodriguez H，O’Connell C，Barker PE，et al.Measurement of DNAbiomarkers for the safety of tissue-engineered medical products，usingartificial skin as a model.Tissue Eng，2004，10(9-10)：1332-1345)。2001年2月6日伍津津等人申请了有关专利(中国专利申请号01107099.4)，该发明包括胶原凝胶的制备和细胞的三维培养等。2002年9月2日金岩等人申请了有关专利(中国专利申请号02139398.2)，该发明包括胶原凝胶的制备和全层皮肤的培养等内容。但这几种皮肤替代物主要用于烧伤和溃疡、创伤等皮肤缺损病人的临床治疗，还不能替代活体动物皮肤成熟用于皮肤毒性检验。作为组织工程皮肤也存在以下缺点：人工表皮由于不含真皮层，还不是真正意义上的人工皮肤；现有的含双层结构的人工皮肤组织构造上还有待改进；培养周期长，皮肤功能在体外维持时间短，不适用于慢性毒性试验。因此，用于毒性检验的皮肤不仅要求形态和组织结构与人体皮肤接近，而且要求生理功能和活性与活体皮肤相似，构建的皮肤重复性好，批间差异小，便于毒性效应的统计学分析。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题，就是提供一种利用诱导分化的表皮干细胞或原代分离的表皮干细胞，采用筏式培养技术，制备毒性检验用全层皮肤的方法，该方法培养周期短，皮肤含表皮与真皮双层结构，组织和结构与正常皮肤相似，功能和活性在体外维持时间较长，能满足毒性检验领域的需要。