[发明专利]一种检测大肠杆菌的新型荧光生物传感器的制备方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种共轭聚电解质诱导荧光放大的超灵敏、高选择性大肠杆菌O157:H7新型荧光生物传感器的制备方法。

背景技术

随着纳米科学技术在生物传感器领域的渗透，生物传感器领域进展最快、研究最多的两大类型是电化学生物传感器与光学生物传感器。由于电化学生物传感器具有灵敏度高、易微型化、能在浑浊的溶液中操作等优点，且所需的仪器简单、便宜。因而被广泛地应用于生物传感器制备；相比而言，光学生物传感器的优点在于无需参比电极，不受电磁场的干扰，可以在非平衡条件下测量某些物质(如氧)，稳定性好，尤其是在双波长的情下，可采用不同的波长监测同一物质的不同状态，但缺点是易受背景光的干扰，动力学范围较窄，不易于小型化，试剂的稳定性也存在一定的问题等。针对以上问题通常从两个方面着手：通过模板扩增在识别体系中引入各种生化反应(如酶切、延伸、联接和扩增等反应，如Taqman探针与分子信标)来提高对生物分子识别能力，提高灵敏度和特异性。或者利用信号放大即采用各种化学标记和物理检测方法来放大生物识别过程的微小差异，从而提高检测的灵敏度和特异性。这些方法包括各种纳米标记、荧光标记、银染技术、分支DNA标记、酶放大标记等生物和化学放大技术等。从而使生物传感器的接受器、换能器或者检测器各部分的过程、反应或信号能直接或间接的放大。

肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，它除引起腹泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重的并发征，后者病情凶险，病死率高。研究发现只要有10个大肠杆菌O157:H7就足以致病。目前，常用的大肠杆菌O157:H7检测方法主要有三类：细菌学分离、免疫学检测以及分子生物学检测。细菌学分离耗时长，操作烦琐，不利于及早诊断。临床上主要采用免疫磁珠法和血清特异性抗体检测。免疫法虽然特异性高，但检测限低，往往仅达到10³～10⁸CFU/ml，而且需要两次增菌，耗时长，也不利于疾病的早期诊断。分子生物学检测技术虽然灵敏度高，尤其是采用最新的DNA探针技术或者基因芯片技术可以达到10²～10³CFU/ml甚至几十CFU/ml的最低检测限，但是往往会出现一定的假阳性，而且需要大型设备、专业及人员，不利于在基层医疗机构和环境监测中的推广。表格1是关于常用的大肠杆菌O157:H7检测方法的对比。

常见检测方法及其灵敏度

近年来，利用高度荧光、水溶性的共轭聚电解质分子结构发展的一大类可对生物分子进行实时检测的高灵敏度检测体系，受到人们的广泛关注，并且相关研究进展很快^[1]。共轭聚电解质包括聚吡咯、聚噻吩、聚苯乙烯等，它们由较大的有效共轭单元构成，彼此间存在着有效的电子耦合和具有快速的分子链内和链间的能量或电子转移能力，因此基于此类型的生物传感器能够对一些微小的扰动给予积极的响应。与其它小分子体系的生物传感器相比，其灵敏度能得到很大的提高。由于这类集体性的响应可影响到化合物一系列的光电子性能，诸如：的荧光共振能量转移(FRET)，电导能力，荧光发光效率等，因此将之用作为荧光生物传感器非常合适。与传统的生物传感器相比，共轭聚电解质生物传感器由于共轭聚合物光电特性的“放大作用”而具有极高的灵敏度，同时聚合物的光电特性的变化是在极快的过程中完成，保证了检测的快速性。因此，共轭聚电解质荧光生物传感器很快成为了国际上的一个新的研究热点。

发明目的

本发明的目的是为了提供一种检测大肠杆菌的新型荧光生物传感器的制备方法，通过利用磁粒捕获富集待分析样本的特定的生物分子(大肠杆菌O157:H7抗原)，产生带荧光标记的生物分子识别体系(抗原抗体结合体)。随后加入水溶性共轭聚电解质，通过共轭聚电解质诱导与静电作用等，共轭聚电解质之间的超分子识别可形成超分子荧光复合物体系。该荧光复合物经共轭聚电解质的光或电激发，导致原荧光标记信号产生数千甚至百万倍数量级的超级荧光放大，从而形成超灵敏、高选择性生物传感器。

发明内容

研究制备出一种共轭聚电解质诱导荧光放大的超灵敏、高选择性大肠杆菌O157:H7生物传感器原型，应用于大肠杆菌O157:H7超灵敏检测。

本发明的目的通过下述方案实现：

磁粒识别捕获大肠杆菌O157:H7抗原、剪切分离后与阳离子共轭聚电解质(CCP)形成超分子荧光复合物，包括下列步骤：