[发明专利]食源性致病菌分子检测标记的建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食源性致病菌分子检测标记的建立方法。

技术背景

食源性致病菌是引起食物中毒，危害人类健康的重要微生物，无论在发达国家还是发展中国家，都是影响食品安全的最主要原因，其中金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特、沙门氏杆菌和副溶血弧菌等是国际公认的危害广泛的四大致病微生物。近年来全球多个国家多次爆发由上述致病菌引起的食源性疾病。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起人类感染和细菌性食物中毒的一种重要致病菌，由它引起的食物中毒发生频率极高。在我国由金黄色葡萄球菌引起的中毒病例占食物中毒总数的20％～25％，是仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌的第三大致病菌。据国外疾病控制中心报道，在美国由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则高达45％。据报道，我国细菌性食物中毒中70％～80％是由沙门氏菌引起的。

目前，食源性病原微生物快速检测的方法是基于核酸的分子生物学的方法，主要有核酸探针法和聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)法。PCR检测方法存在着检测准确性高(10⁵cfu/mL)和检测时间短(8h)等优势，其准确度主要取决于使用的检测标记的特异性。目前已报道的食源性致病菌分子检测标记有几十多种，这包括金黄色葡萄球菌肠毒素基因(entA、entB、entC1、entD和entE)、耐热核酸酶基因(nuc)、表皮剥脱毒素(eta和etb)基因和中毒性休克综合症毒素基因(tst)、耐甲氧西林基因(mecA和femA)、16S-23S rRNA、沙门氏菌的invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、rfb、agfA、viaB、SPV、单核增生李斯特菌的hlyA、iap、inlA、inlB、prfA、plcA、plcB、mpl、志贺氏菌的ial和virA、副溶血性弧菌的tdh、trh和肠出血性大肠埃希氏菌的hly、slt、eae基因等。但是越来越多的研究表明，现有的致病菌的检测标记都是通过比较繁琐和较长时间的研究工作而获得的，其数量少、特异性低，而且利用已有的分子检测标记建立的检测方法在实际检测出现了假阳性和假阴性的错误结果，这就要求人们建立一种新的分子检测标记的发掘方法，以便发掘特异性更高的分子检测标记，以解决食源性致病菌分子检测方法的不足。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的食源性致病菌分子检测标记特异性不高、检测方法存在误检等问题而提供一种食源性致病菌分子检测标记的建立方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种食源性致病菌分子检测标记的建立方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.收集一种食源性致病菌的所有基因组序列；

b.选取步骤a中获得的基因组序列中的任一基因组切分成长度为500～1000bp的片段，将每个切分片段与其余的基因组序列进行比对，保留相似性达到98％以上的切分片段，得到保守序列片段；

c.将步骤b获得的保守序列片段中的任一片段与其他微生物基因组序列进行比对，剔除保守序列片段中与其他微生物基因组序列相同的片段，则保留下来的序列片段即为该食源性致病菌的特异性标记群；

d.将步骤c获得的特异性标记群中的数据信息进行筛选，得到食源性致病菌分子检测标记。

与现有技术相比，本发明的方法具有如下显而易见的突出特点和显著优点：

1、本发明首次提出了利用生物信息学和微生物基因组学相结合发掘食源性致病菌分子检测标记的方法。

2、本发明方法获得的食源性致病菌分子检测标记的特异性比现有的分子检测标记的特异性要高。

3、本发明不需要进行分子克隆、基因测序、PCR等分子生物学实验，可以节约财力。

4、本发明获得的分子检测标记数量大，可以进一步深入研究和利用。

5、本发明获得分子检测标记能够满足生物芯片对检测标记的要求。

6、本发明方法同样适合于其他微生物的分子检测标记的发掘。

附图说明

图1本发明方法的实施例流程图

具体实施方式

下面以金黄色葡萄球菌分子检测标记的建立方法为具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例一具体步骤如下：