[发明专利]小而密低密度脂蛋白的微流控电泳分析方法

权利要求书

1.一种小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于所述的分析方法是基于微流控分析方法与荧光检测方法的结合，对血清脂蛋白进行分离和分析，具体分析步骤是：

(a)电泳缓冲体系的选择：

所选择的缓冲液的pH9.0，是由40mmol/l Tricine、40mmol/l甲基葡胺、0.03mmol/l十二烷基硫酸钠，其余为去离子水组成；

(b)血清标本的准备和标记

受试者素食三天后，清晨空腹采血3ml，以3000r/min速率离心10min分离血清，所取血清标本4小时之内完成分离检测，或-70℃保存；2μl血清样本溶于8μl去离子水，然后用2μl 0.1g/l硝基苯并噁二唑-6-酰基鞘醇进行避光预染，1分钟后加入50μl缓冲液，作为电泳待测标本；

(c)微流控芯片电泳

所述的微流控芯片采用石英玻璃为制作材料，经光刻、湿法腐蚀、低温键合而成，芯片微管道宽100μm，深为30μm，试样池(1)和试样废液池(2)之间管道为进样通道，缓冲液池(3)和缓冲液废液池(4)之间管道为分离通道；

分析前，用1mol/L NaOH浸洗各池和通道，然后用去离子水浸洗，试样废液池(2)、缓冲液池(3)和缓冲液废液池(4)加入分离缓冲液后，试样池(1)中注入待测样本，进样阶段，试样池(1)+750v，试样废液池(2)接地，缓冲液池(3)+300v，缓冲液废液池(4)+450v，进样40秒后切换电压进入分离阶段；分离时，缓冲液废液池(4)0v，缓冲液池(3)+3000v，试样池(1)和试样废液池(2)均施加+300v；

微流控芯片电泳仪器的激光激发波长为488nm，荧光采集滤光片的波长为500nm-580nm，荧光信号由光电倍增管收集后转换为电信号由计算机对信号进行采集和处理，系统可调输出电压为0～5000V，实验所得数据用Microsoft excel和Origin 8.0进行处理，转换为荧光强度与迁移时间的关系。

(d)结果判读

图谱和数据采用Excell，Origin7.5和SPASS11.5软件包处理，先由脂蛋白标准品做出标准电泳图谱，再选择临床标本进行比对分析，得到冠心病危险因子sdLDL的出峰时间、相对含量等参数。

2.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于缓冲液中十二烷基硫酸钠作为阴离子表面活性剂同时修饰脂蛋白和芯片微通道表面。

3.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于所使用的微流控芯片的尺寸为63.5mm×31.75mm。

4.按权利要求1或3所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于所述的微流芯片中的进样通道长28mm，十字交叉进口到检测点间的长度为45mm。

5.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于分析前用1mol/L NaOH浸洗各池和通道时间为1分钟，然后去离子水浸洗2分钟。

6.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于所述的微流芯片的进行温度为25℃。

7.按权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于步骤c中分离阶段时间为3min。

8.按权利要求1或7所述的小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，其特征在于正常人血清样本中分离到大而轻低密度脂蛋白和高密度脂蛋白两个特征峰；冠心病患者血清中分离到大而轻低密度脂蛋白、小而密低密度脂蛋白和高密度脂蛋白三个特征峰。