[发明专利]小而密低密度脂蛋白的微流控电泳分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种冠心病危险因子——小而密低密度脂蛋白微流控电泳分析方法，所述的分析方法是基于微流控分析技术和激光诱导荧光检测技术的结合，分析血清脂蛋白亚型，可用于临床冠心病、动脉粥样硬化等疾病的预测、判断和疗效观察，属生化分析领域。

背景技术

脂蛋白是纳米大小的颗粒，根据超速离心法可将其主要分为三类：高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low denselipoprotein，LDL)和极低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein，VLDL)。临床、遗传学、流行病学的研究证实，血清中低密度脂蛋白与动脉粥样硬化性心脑血管疾病密切相关。血清低密度脂蛋白具有异质性，由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成，不同的LDL颗粒具有不同的大小、浮力、密度、化学组成、理化特性等。小而密的低密度脂蛋白(Small & Density LowDensity Lipoprotein，sdLDL)是“LDL亚组份”中密度高而颗粒小的一种亚型，近年来对sdLDL与冠心病的关系进行了深入的研究。大量的流行病学和病理学表明，sdLDL与冠心病直接相关，作为预测冠心病的指标，它比LDL-C更佳。sdLDL升高者，CHD及心肌梗塞(MI)的危险性分别是对照组的4.5及6.9倍。2002年全美胆固醇教育计划(NCEP，National Cholesterol EducationProgram Adult Treatment Panel III)认为sdLDL在动脉粥样硬化的发生中起重要作用，是冠心病的强危险因子，并推荐对这种脂蛋白进行检测。

目前国内外报道已从多个侧面对脂蛋白进行分析，但亟需解决的问题是LDL亚组分缺乏简易的分析方法，超速离心机较贵重，梯度电泳较繁琐，影响了该项目的普及。质子核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)光谱法分析脂蛋白亚型尚处于研究阶段，毛细管电泳是继高效液相色谱之后分析科学的一大进展，使单细胞，甚至单分子分析成为可能。有关研究使用CZE、CITP分离sdLDL，并结合临床进行了初步探讨，显示了此技术分析sdLDL的强大优势。但该方法分离LDL亚型需要不同的缓冲体系、不同的分离模式才能实现，至今还没有在临床上得到应用。

本发明拟将微流控分析与激光诱导荧光检测技术结合起来，建立一种快速、高效分离分析sdLDL的方法，也即提供一种冠心病危险因子的快速检测方法，用于临床上对冠心病的预测、判断及疗效观察。

发明内容

本发明目的在于提供一种小而密低密度脂蛋白的微流控电泳方法，所述的方法是基于微流控分析方法和激光诱导荧光检测方法的结合，针对血清脂蛋白进行快速分离和分析，从而建立起的一种快速、高效分析冠心病危险因子sdLDL的方法，用于临床上对冠心病、动脉粥样硬化等疾病的预测、判断及疗效观察。

具体的说本发明是通过血清标本标记、微流控芯片电泳、荧光检测以及结果分析等过程实现的。具体技术方案阐述如下：

1)电泳缓冲体系的选择：

缓冲液(Background electrolyte)pH 9.0，是由40mmol/l Tricine、40mmol/l甲基葡胺、0.03mmol/l十二烷基硫酸钠，其余为去离子水组成。

2)血清标本的准备和标记

受试者素食三天后，清晨空腹采血3ml，以3000r/min速率离心10min分离血清，所取血清标本4小时之内完成分离检测，或-70℃保存。血清样本(2μl)溶于8μl去离子水，然后用2μl 0.1g/l硝基苯并噁二唑-6-酰基鞘醇(NBDC₆-ceramide)(乙二醇∶甲醇为9∶1的混合液预先溶解)进行避光预染，1分钟后加入50μl缓冲液，作为电泳待测标本。

3)微流控芯片电泳

微流控芯片结构如图1所示。所述的芯片采用石英玻璃为制作材料，经光刻、湿法腐蚀、低温键合而成，整个芯片大小为63.5mm×31.75mm，芯片微管道宽100μm，深约30μm，试样池1和试样废液池2之间管道为进样通道，缓冲液池3和缓冲液废液池4之间管道为分离通道。进样通道长28mm，有效分离长度(十字交叉进样口到检测点间的长度)为45mm，储液池的直径为2mm。