[发明专利]一种分支杆菌差异表达系统及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种分支杆菌差异表达载体----pMFA系列，其特征是以结核杆菌furA基 因的启动子pfurA及其突变体实现外源基因在分支杆菌中差异表达；通过下述方 法制备：

用下游引物pfurA-R1-4分别与同样的上游引物pfurA-F配对，对结核分支杆 菌furA基因操纵子PCR扩增，分别产生启动子pfurA、启动子pfurAm，启动子 pfurAa，启动子pfurAma后，上述启动子分别克隆至启动子探针载体pMC210， 并亚克隆至父系穿梭载体pMV261中，取代其BCG phsp60启动子及部分酶切位 点，建立分支杆菌差异表达载体，命名为pMFA系列；

所述的启动子pfurAm是AT富集区序列6-bp替换突变的启动子，其中，突 变形式为furA基因启动子上游AT富集区AGAGGA突变为TCTCCT；所述的启 动子pfurAa是起始密码GTG突变为ATG的启动子，所述的启动子pfurAma为 兼有启动子pfurAm和pfurAa突变的启动子；

所述的下游引物pfurA-R1-4与上游引物pfurA-F的序列为：

引物pfurA-F：5’-GGTCTAGAGGCGGGCACCGGGACACAC-3’

引物pfurA-R1：5’-CGCGGATCCGTCCGGTATAGAGGACACACT-3’

引物pfurA-R2：5’-CgCGGATCCGTCCGGTATAGAGGACACACTAGA CAATATGACTCCCAGGAGAGGAAT C-3’

引物pfurA-R3：5’-CGCGGATCCGTCCGGTATAGAGGACATACT-3’

引物pfurA-R4：5’-CgCGGATCCGTCCGGTATAGAGGACATACTAGA CAATATGACTCCCAGGAGAGGAAT C-3’；

所述的探针载体pMC210是以pSV-β-gal质粒为模板，lacZ-F和lacZ-R为 引物，PCR扩增获得截短的大肠杆菌lacZ基因片段，经BamHI-HindIII双酶切 消化后克隆至pBluescript KS得pKS-LacZ’，质粒pMV261经XbaI-HindIII双酶 切消化去除BCG hsp60启动子，与经过pKS-LacZ’酶切消化得到的lacZ’片段连 接，制得；所述的lacZ-F和lacZ-R引物的序列分别为：

引物lacZ-F：5’-CGCGGATCCGTCGTTTTACAA CGTCGTG-3’

引物lacZ-R：5’-CCAAGCTTTCATTATTTTTGACACCAGACCAAC-3’。

2.权利要求1所述的分支杆菌差异表达载体----pMFA系列在制备重组卡介 苗中的用途。