[发明专利]一种镰孢菌纤溶酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体地说，涉及一种镰孢菌纤溶酶及其制备方法。

背景技术

血栓病是由于血栓引起的血管腔狭窄与闭塞，是主要脏器发生缺血和梗塞而引发机能 障碍的疾病。血栓病属于心脑血管疾病，据统计，全球每年脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞、 冠心病、动脉硬化等心脑血管疾病夺走1200万人的生命，接近世界总死亡人数的1/4， 成为人类健康的头号大敌。我国每年死于心脑血管疾病的人数达到260万人以上，存活的 患者75％致残。尽管血栓形成与血管及诸多因子有关，然而溶栓疗法是心脑血管栓塞性 疾病的一种常规治疗手段。根据其不同的作用机制，溶栓剂可分为两种类型1、纤溶酶原 激活剂，如组织型血纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶(UK)，链激酶(SK)等，这类物 质激活纤溶酶从而降解纤维蛋白。2、纤维蛋白溶酶，如蚓激酶、多种蛇毒抗栓酶，这类 物质能直接降解血液中的纤维蛋白。目前临床上使用的溶栓药物，在治疗血栓性疾病方面 有一定的作用，但也存在很大的缺陷，如UK和SK的特异性较低、使用中可能会造成血 纤溶酶过量激活，导致纤维蛋白原过量降解，引发全身出血，同时SK还具有很强的免疫 原性，重复使用容易引起变态反应。tPA虽然对纤维蛋白的亲和力很强，因而非常有效， 但是这种酶非常昂贵，病人有可能会出现胃肠道出血，过敏反应。这些现有的溶栓药物的 不足，迫使人们从新的来源中去研制更有效的溶栓药物。

微生物是溶栓药物的重要来源，目前从微生物中分离纤溶酶已有一些报道，其中包括 枯草杆菌(Bacillus sp.)、链霉菌(Streptomycin)、豆豉杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、 根霉(Rhizopus chinesis)以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)等。近年来不断筛选到 许多能产生纤溶酶的微生物，但利用菊花茎内生镰孢菌来分离制备纤溶酶，还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的纤溶酶——镰孢菌纤溶酶。

本发明的另一目的在于提供所述镰孢菌纤溶酶的制备方法。

本发明提供的镰孢菌纤溶酶来源于菊花茎内生真菌镰孢菌(Fusarium sp.)。

其中，所述菊花茎内生真菌镰孢菌(Fusarium sp.)的保藏号为CGMCC No.2347。

本发明所述镰孢菌纤溶酶的N-末端氨基酸残基序列为：QASSGTPATIRVLVV；分 子量为28,000Da；等电点为8.1。

根据本发明，所述镰孢菌纤溶酶的纤溶作用可被苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸抑制。

根据本发明，所述镰孢菌纤溶酶的制备方法，包括以下步骤：

A)将菊花茎内生镰孢菌进行发酵培养；

B)从发酵液中分离纯化得到镰孢菌纤溶酶。

其中，所述步骤B)包括以下步骤：

C)发酵液中加入硫酸铵分级盐析，离心收集沉淀；

D)溶解沉淀，经微滤收取透出液，再经超滤膜超滤，收取截留液；

E)截留液以Sephadex G-25柱层析或透析法脱盐；

F)以MonoQ阴离子层析，用NaCl洗脱，收集活性峰的洗脱液，洗脱液经G-25柱 层析脱盐后冷冻干燥，得到镰孢菌纤溶酶的粗酶；

G)所得的镰孢菌纤溶酶粗酶经Superdex 75凝胶层析，收集活性峰，冻干后得到电 泳纯的镰孢菌纤溶酶。

本发明的镰孢菌纤溶酶可应用于制备溶栓药物。

本发明的镰孢菌纤溶酶及其制备方法的优点为：该酶具有能直接降解纤维蛋白的纤溶 活性，有良好的血栓溶解和抑制静脉血栓形成的作用，并且分子量较小，同时，该酶的生 产原材料丰富，生产工艺简便，成本低廉，能弥补尿激酶等现有临床药物在生产和治疗方 面的不足，因此具有开发价值。

附图说明

图1是镰孢菌纤溶酶HCCB00699S1的纤维蛋白平板图。

图2是镰孢菌纤溶酶HCCB00699S1降解纤维蛋白活性特征的平板图。

图3是镰孢菌纤溶酶HCCB00699S1的SDS-PAGE电泳结果图，其中S为标准品，1 为样品。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。