[发明专利]黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法和应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物技术领域的标记方法，尤其是一种黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法和应用方法。

背景技术

霜霉病(downy mildew)是世界各地黄瓜(Cucumis sativus L.)产区的重要病害之一，在我国，霜霉病与霜霉病、枯萎病并列为黄瓜三大病害。黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉病菌[Pseudoperonospora cubensis(Berk.& Curt.)Rostov.]引起，该病原菌属鞭毛菌亚门，霜霉菌目，假霜霉属。其主要危害黄瓜叶片，在苗期、成株期均可发病。在适宜的条件下，它的病情发展很快，几天时间便会蔓延到全田，造成叶片发黄、枯死，减产30％-50％。

随着分子标记辅助育种技术的迅速发展，为有效的解决这个问题提出了新的方法。通过构建重要抗源的遗传图谱和数量性状位点(Quantitative TratitLoci，QTL)分析，可以找到与黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁(或共分离)的分子标记。Johan D，TRENDS in Plant Science(植物科学趋势)，2003，Vol.8 No.7；Meglic V，Theor Appl Genet(应用遗传理论)，1996，92：865-872，该文报道使用与某一特定抗源抗霜霉病主效QTL连锁的分子标记，可以对该特定抗源的后代及其衍生品种(系)在苗期进行早代筛选，淘汰不抗病的植株，节约常规育种的生产成本，提高育种和选择效率。S94是中国华北陆地型黄瓜品系，很多黄瓜育种家已经把它作为抗霜霉病亲本，其霜霉病抗性主效QTL相连锁的分子标记。

使用杀菌剂和推广抗病品种是抵抗霜霉病危害的主要方法。长期使用杀菌剂会危害环境安全，且易引起病菌小种变异产生拮抗作用。种植抗病品种是安全、环保和高效的控制策略。大量前人工作(吕淑珍，天津农林科技，1990，2：22-24；van Vliet G J A.，Pierce L K，Hortscience(园艺科学)，1990，25：605-615；Meglic V，Theor Appl Genet(应用遗传理论)，1996，92：865-872)已表明，黄瓜霜霉病的抗性遗传机理复杂。常规育种实践中，对于抗霜霉病材料的选择是十分困难的：一方面选育周期长；另一方面霜霉病的发生受到很多因素的综合影响，例如：温度、湿度和病菌小种等，鉴定抗性材料的过程不容易控制。这些都导致黄瓜霜霉病育种进展缓慢的重要原因。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的现状，提供一种黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法。使其在黄瓜抗霜霉病育种中应用，用以界定与S94的霜霉病抗性主效QTL相连锁的分子标记，通过检测这些分子标记可以预测黄瓜植株的霜霉病抗性，加快抗霜霉病黄瓜的选择进度，在生产上用于检测黄瓜品种的霜霉病抗性水平。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所涉及的黄瓜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记方法，包括以下步骤：

a)得到黄瓜霜霉病抗病品种S94(♀)和黄瓜霜霉病感病品种S06(♂)和杂交，得到杂种F₁；

b)由杂种F₁自花授粉获得F₂子代，通过子代单粒传(SSD)方法获得F₇代的重组自交系；

c)对重组自交系每个株系进行分子标记分析，并对重组自交系每个株系的基因型进行描述；具体方法：分离重组自交系每个株系的基因组DNA，采用相关序列扩增多态性(SRAP)、微卫星(SSR)、序列特异性扩增区(SCAR)和序列标签位点(STS)分子标记引物进行PCR扩增，扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶(SCAR、STS)和6g/100ml聚丙烯酰胺凝胶(SRAP、SSR)上电泳分离后，获得分子标记资料；

d)基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，用获得的分子标记资料构建遗传连锁图；

e)测定重组自交系每个株系的霜霉病抗性；

f)将重组自交系每个家系的霜霉病抗性与黄瓜遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，QTL分析采用WinCart QTL2.1进行，先进行Kruskal-Wallis(K-W)测验，P＜0.005表明该标记与霜霉病抗性连锁，可能存在QTL，然后对可能存在QTL的区间进行复合区间作图，以2.5为LOD阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点，从而确定与抗源S94霜霉病抗性主效QTL的分子标记E23m18d、CMBR40和CMBR97。