[发明专利]内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的规模化制备方法，特别是一种内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法。

背景技术

β-1，4-内切木聚糖酶(亦称之为β-1，4-木聚糖水解酶，EC 3.2.1.8)是一种能够降解生物质原料中半纤维素组分生成聚合度大大降低的寡聚木糖，直至三聚木糖、二聚木糖和单分子木糖，在造纸工业、动物饲料行业、面包制作、饮料和酿酒工业、以及正在发展的生物质绿色化工和生物质能源行业都有重要用途。

经对现有技术的文献检索发现，Damiano等人发表在《Appl BiochemBiotechnol》(《应用生物化学和生物技术》，2006年129-132卷289-302页)上发表了题为“Purification and characterization of two xylanases fromalkalophilic and thermophilic Bacillus licheniformis 77-2”(“耐碱嗜热细菌中两种木聚糖酶的纯化和鉴定”)的论文，提出如下内切木聚糖酶制备的技术方案：细菌培养液首先过G-75凝胶过滤处理、再依次过CM-sephadex和Qsepharose离子交换层析操作，最终获得内切-β-1，4-D-木聚糖酶。与文献报道的其它内切木聚糖酶纯化方法类似，该方法采用多种分离方法组合，操作步骤多，生产过程长且复杂，消耗人力、试剂、能源大，设备利用率低；尤其是使用凝胶过滤操作每个循环处理量少，效率低、难于规模化制备。因此需要发展先进高效纯化生产方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种内切木聚糖酶的仿生亲和纯化方法，能够简捷、批量纯化制备内切木聚糖酶。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明以内切木聚糖酶专用亲和分离材料作为基础，其步骤如下：

第一步，制备仿生亲和分离材料

仿生亲和分离材料是通过三氮嗪结构骨架作为间臂依次固定对氨基苯磺酸和L-色氨酸两个基团，首先用三氯三氮嗪活化的基础层析介质(二氯三氮嗪-介质)与对氨基苯磺酸反应得到胺对苯磺酸一氯三氮嗪-介质，再与L-色氨酸反应，得到胺对苯磺酸-L-色氨酸三氮嗪-介质，称为仿生亲和分离材料，这种仿生亲和分离材料的关键是对氨基苯磺酸和L-色氨酸两个基团通过三氮嗪结构骨架组合到基础层析介质上；

所述反应得到胺对苯磺酸一氯三氮嗪-介质，其反应温度为50℃。

所述再与L-色氨酸反应，其反应温度为95℃。

所述基础层析介质是葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖-N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚分离材料、甲基丙烯酸聚合分离材料、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖凝胶，琼脂糖与葡聚糖的交联共聚物、聚丙烯酰胺—琼脂糖复合物珠、纤维素珠或涂有化学活性基团的硅胶中的一种。

所述的仿生亲和分离材料，其配体结构含对胺基苯磺酸结构和L-色氨酸结构。

第二步，用仿生亲和分离材料纯化纤维素酶粗品

将内切木聚糖酶粗品直接上样至用结合缓冲液预平衡的装有仿生亲和分离材料的层析柱中，清洗去除未结合杂质组分，再用洗脱缓冲液从柱中洗脱内切木聚糖酶，获得内切木聚糖酶纯品。

所述结合缓冲液pH5.0-10.0。

所述洗脱缓冲液pH2.0-10.0，含NaCl 0.0-1.0M NaCl。

所述的内切木聚糖酶，其原料为天然微生物发酵，或通过基因工程技术改造的微生物发酵液，或菌体破碎液，包括Hypocrea jecorina发酵液。

本发明的仿生亲和分离材料上的化学基团能够与内切木聚糖酶分子发生高度特异的非共价和可逆的识别和结合，内切木聚糖酶与分离材料接触时，能够与该化学基团结合吸附在分离材料上，未结合的杂质被平衡缓冲液清洗被除去。再用不同缓冲液条件，如盐种类、浓度、酸碱度将吸附在分离材料上的内切木聚糖酶特异解离洗脱，从而制备高纯度的内切木聚糖酶。

本发明克服了现有内切木聚糖酶纯化技术中操作步骤多，生产过程长且复杂，消耗人力、试剂、能源大，设备利用率低的缺点，实现了步骤少、生产周期短、效率高、成本低的优势，能够快速、简便、批量纯化制备内切木聚糖酶。

具体实施方式

以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1