[发明专利]替曲卡星A的生物合成基因簇及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及抗生素替曲卡星A(Tetrocarcin A) 的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

Tetrocarcins是一类新型的螺环乙酰乙酸内酯类抗生素，首次分离自青褐色小单 孢菌KY11091(Micromonospora chalcea KY11091)的发酵产物[J.Antibiot.(1980)33， 668-670]。替曲卡星A(如图1所示)是其中的一个组分，其分子中含有苷元和糖 基两部分：苷元Tetronolide结构非常独特，其中含有一个反式萘环及一个螺-4-羟基 乙酰乙酸内酯(Spirotetronate)单元；苷元的C9位连有由两个L-阿米西糖和两个 L-毛地黄毒糖交替连接而成的四糖边链，且一个L-毛地黄毒糖的4位羟基被乙酰化 修饰；苷元的C17位则连接了一个罕见的，高度修饰的硝基脱氧糖Tetronitrose。

替曲卡星A是螺环乙酰乙酸内酯类抗生素中生物活性最好的一个化合物。它对 部分革兰氏阳性菌具有较强的抑制活性，比如对枯草杆菌Bacillus subtilis No.10707 的最低抑制浓度(MIC)低至0.1μg/ml[J.Antibiot.(1980)33，244-246]。对替曲卡星 A的构效关系研究表明，随着寡糖侧链中糖基的逐个被去掉，替曲卡星A的抑菌活 性逐渐降低，这一结果显示出糖基基团在抗菌过程中的重要作用[Bioorg.Med.Chem. Lett.(2001)11，887-890]。替曲卡星A的抗菌机制可能是抑制细菌RNA的合成，并 对蛋白的合成有部分影响，但不影响细菌DNA的合成。在对替曲卡星A抗肿瘤活 性的研究中发现其对部分肿瘤，包括白血病细胞P388、Ehrlish肿瘤细胞、MH134 肝肿瘤细胞、B16黑色素肿瘤细胞等，均具有强烈的抑制效果[J.Antibiot.(1980)33， 946-950]，同时没有明显的骨髓抑制和肾毒性等毒副作用[J.Antibiot.(1982)35， 1033-1037]。因此，其良好的生物活性促使人们对其抗肿瘤作用机制进行了深入研 究。1983年以来，对替曲卡星A抗肿瘤机制研究的结果表明，它能够拮抗膜整合蛋 白Bcl-2抑制细胞凋亡的作用，从而增加癌细胞对诱导其凋亡信号的敏感性和弱化 癌细胞对于物理或化学药物治疗的抗性。Kaneko小组以替曲卡星A为基础进行化 学结构衍生得到了一系列替曲卡星A结构类似物，活性测试结果表明，一些保留抑 制Bcl-2活性的结构类似物并不具备抗菌的能力，这一结果暗示了替曲卡星A可能 通过不同于抗菌机制的新作用机制来体现其抗肿瘤活性[Bioorg.Med.Chem.Lett. (2001)11，887-890]。值得注意的是，分别以T-急性淋巴细胞白血病(T-ALL)和B- 慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)肿瘤细胞为模型的细胞凋亡实验结果表明，替曲卡 星A可能是通过激活一条内质网应激通路(ER-stress pathway)而诱导细胞凋亡的 发生[FESB(2002)16，1295-1297]。也有研究者认为，替曲卡星A诱导细胞凋亡的机 制是因为它能够降低线粒体跨膜电位，导致细胞色素C的释放和半胱天冬酶-9前体 的活化而诱导细胞凋亡。由于替曲卡星A诱导细胞凋亡的过程不受Bcl-2、HSP70 等抗凋亡因子的影响——这些蛋白的过量表达将钝化化疗药物Prednisolone、 Chlorambucil或Fludarabine的作用，这一现象提示我们可以将替曲卡星A用于对现 有临床化疗药物产生抗性的B-CLL肿瘤病人的治疗。同时，B-淋巴细胞对于替曲卡 星A的敏感性远远高于内源性的T-淋巴细胞，显示替曲卡星A对治疗B-CLL肿瘤 可能具有较好的特异性[Blood(2003)101，4561-4568]。另外，替曲卡星A通过对人 乳腺癌细胞中的P13K/Akt信号通路中一些因子磷酸化的抑制作用而达到对该肿瘤 细胞生长的抑制[Biochem.Biophys.Res.Commun.(2007)356，260-265]，可以通过进 一步的研究将其发展成为治疗乳腺癌的有效药物。