[发明专利]生物催化法制备4－氰基－3－羟基丁酸乙酯的两种高光学活性对映体

说明书

技术领域

本发明涉及(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的制备方法，更具体地说利用它们催化不对称还原生产手性β-羟基丁酸酯的微生物转化方法。

背景技术

光学活性手性仲醇是许多手性药物和手性精细化学品合成的重要中间体，其合成方法通常包括酮的不对称还原以及消旋体的不对称拆分。

通过对外消旋体的拆分制备光学活性手性仲醇可以采用天然或者人工合成的手性拆分试剂，也可以用生物酶法，但是手性拆分试剂的来源远不如生物酶法的种类众多，所以最为常见的莫过于采用商品化的酯酶或者脂肪酶进行水解拆分，但是，对于拆分来讲，其最大产率也不会超过50％，工业化的时候通常还需考虑其另一对映体的处理，有时候丢弃另外一半也是无奈之举。

因此，更为经济的考虑是潜手性酮的不对称还原，理论上能得到100％的转化结果。基本方法有化学法还原和生物催化还原，一般在无水无氧条件苛刻的情况下，使用手性配体和过渡金属配合物作为催化剂，其产率往往很高。但废弃的重金属催化剂往往无法后处理，掩埋是唯一途径，然而又会对环境不利，而且该类催化剂往往价格昂贵，其工业化成本较高。

生物催化法制备光学活性手性仲醇以其独特的优势正逐步受到关注。高选择性是酶催化的最大特点，此外，生物催化法往往较为迅速，而且副产物较少，后处理简单，省却了诸多化学合成中的对敏感基团的保护和脱保护步骤。利用整细胞进行催化无需添加辅酶，也不需要进行酶的纯化，可以更进一步的节省工业化生产成本。

(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯((R)-ethyl 4-cyano-3-hydroxybutyrate)是一个非常重要的手性化合物，它是合成HMG-CoA还原酶抑制剂Atorvastatin(Lipitor)的中间体，HMG-CoA还原酶抑制剂可以控制胆固醇的生物合成。它还是合成L-Carnitine和(R)-4-amino-3-hydroxybutyricacid(GABOB)的中间体。L-Carnitine是运送长链脂肪酸通过细胞膜进入粒线体代谢，以产生能量的运输工具，它常做为营养补充品，供运动员用，而且常见于婴幼儿的营养品中。(R)-4-amino-3-hydroxybutyric acid(GABOB)是gamma-aminobutyric acid的收缩剂，该类药物可以用做控制一些临床反应如精神分裂症，癫痫症等。

目前报道其合成路径主要有以表氯醇或者(S)-3-羟基-γ-丁内酯为起始原料，也有从4-氯-3-羟基丁酸乙酯经过氰基化而得到，但直接采用酶法不对称催化还原4-氰基-3-羰基丁酸乙酯，尚未见文献报道。

发明内容

本发明提供一种新的能有效催化不对称还原反应生产手性β-羟基丁酸酯的方法，利用生物催化法催化还原4-氰基乙酰乙酸乙酯，以获得高产率，高光学纯度的(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。

在本发明中，能有效催化不对称还原反应生成手性β-羟基丁酸酯的两株菌株，其中一株经过LB琼脂培养基后，革兰氏染色表明，该菌为革兰氏阳性菌，菌的大小为2～3μm×1μm，短杆状，两端钝圆，无鞭毛和荚膜，成单排列，芽孢椭圆位于菌体两端，被DSMZ命名为Bacillus pumilusPhe-C3，保藏编号：DSM-355。另一株在经过LB琼脂培养基后，革兰氏染色表明为革兰阴性杆菌，为较短粗的杆菌，大小0.5-1μm×2μm，短链状排列，无芽孢，无鞭毛，有较厚的荚膜，有菌毛，被DSMZ命名为Klebsiellapneumoniae Phe-E4，保藏编号：DSM-2026。

本发明利用上述两种菌株Klebsiella pneumoniae Phe-E4和Bacilluspumilus Phe-C3可以用于生产高光学纯的(±)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，Klebsiella pneumoniae Phe-E4用于生产S构型，Bacillus pumilus Phe-C3用于生产R构型。具体包括以下步骤：

(1)将上述菌株进行划板、摇瓶培养、发酵罐培养，得到的菌液离心获得湿菌体；

(2)将(1)所得的湿菌体分散到磷酸盐缓冲液中去；

(3)将底物4-氰基乙酰乙酸乙酯加入(2)所述的体系中去反应，然后从反应体系中收集还原产物。

其中，所述的4-氰基乙酰乙酸乙酯以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料进行合成的。

步骤(1)中的划板培养所用的培养基为LB琼脂培养基，其组成为：蛋白胨：1％；酵母浸膏：0.5％；氯化钠：1.0％；琼脂：1.5％；其余为蒸馏水。pH为7.0。