[发明专利]利用SAMPL技术进行不结球白菜分子标记的方法

权利要求书

一种利用SAMPL技术进行不结球白菜分子标记的方法，其特征在于，包括步骤如下：

①DNA提取，

②DNA酶切-连接体系的优化，

③SAMPL预扩增体系的优化，

④SAMPL扩增体系的优化、电泳、银染显色，

⑤聚类分析；

其中：

所述DNA酶切-连接体系的优化，具体为：对DNA样品使用EcoRI、MseI或PstI酶中的一种进行酶切，并用T4-DNA连接酶把相对应的EcoRI、MseI或PstI的接头连接上去，采用26μL反应体系，分成两步：第一，13.5μL酶切反应体系包括2-5U的酶和50-250ng的DNA，在37℃水浴3-8小时；第二，连接反应体系包括13.5μL酶切液、1-4pmol的EcoRI接头或PstI接头或者10-40pmol的MseI接头、0.2-1U的T4-DNA连接酶、2-8μmol的ATP，在室温下过夜，产物稀释一倍，-20℃保存备用；

所述SAMPL预扩增体系的优化，具体为：采用10μL反应体系进行SAMPL预扩增，其中1-5mmol·L^-1MgCl₂，0.1-0.5mmol·L^-1dNTPs，10-80ng的预扩引物，0.1-1U Taq聚合酶，0.2-2μL酶切连接产物；预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；

PCR扩增程序采用94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒，共24个循环，最后72℃延伸30分钟；

预扩引物为一个，是与酶切中所选择的酶所对应的引物，其序列为：

E00  5′-GACTGCGTACCAATTC-3′

M00  5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′

P00  5′-GACTGCGTACATGCAG-3′；

所述SAMPL扩增体系的优化，具体为：采用20μL反应体系进行SAMPL扩增：1-5mmol·L^-1 MgCl₂，0.1-0.5mmol·L^-1 dNTPs，30-150ng的引物，0.2-2 U Taq聚合酶，2-6μL预扩增产物；

PCR扩增程序采用94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，65-56℃复性30秒，每个循环降低0.7℃，72℃延伸60秒，共12个循环；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒，共24个循环，最后72℃延伸30分钟；

选择扩增引物有两个，一个是与预扩增引物相对应的引物，在E00、M00或P00序列后增加1-3个碱基，另一个引物为SAMPL引物。

2、根据权利要求1所述的利用SAMPL技术进行不结球白菜分子标记的方法，其特征是，所述DNA提取，具体为：选取两叶期不结球白菜的一片真叶，利用CTAB法提取DNA，提取的DNA稀释到50-250ng·μL^-1，4℃保存备用。