[发明专利]利用SAMPL技术进行不结球白菜分子标记的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农作物育种技术领域的分子标记方法，具体是一种利用SAMPL(选择性扩增多态微卫星位点)技术进行不结球白菜分子标记的方法。

背景技术

基于PCR(聚合酶链反应)技术的第二代分子标记，如AFLP(扩增片段长度多态性)和SSR(简单序列重复)，都已成为当前分子标记辅助选择的重要技术手段。分子标记辅助选择技术作为现代分子生物学与传统遗传育种的结合点，借助分子标记可以对育种材料从脱氧核糖核酸水平上进行选择，加快选择进度，增强选择的准确性，从而显著提高育种效率，所以第二代分子标记技术已经被广泛地应用于育种工作中。

经对现有技术的文献检索发现，SAMPL是Morgante M.在美国专利Compoundmicrosatellite primers for the detection of genetic polymorphisms(专利号：US 5955276)的基础上由AFLP技术发展而来的，被Witsenboer H.等人首次运用于莴苣的研究，发表在《Genome》(基因组)1998年第40卷第6期的923页至936页，题目为Identification，genetic localization，and allelicdiversity of selectively amplified microsatellite polymorphic loci inlettuce and wild relatives(Lactuca spp.)(选择性扩增多态微卫星位点在莴苣和野生品种的鉴定、遗传定位和等位基因多样性研究中的应用)。SAMPL结合了AFLP和SSR两种技术的优点，不需要SSR中的克隆和序列分析，也克服了AFLP显性条带过多的不足，被Roy J.K.等人(2002年)认为是仅次于SNPs(单核苷酸多态性分型技术)的最有效的分子标记体系，Roy J.K.等人(2004年)和Singh A.等人(2002年)分别证明了SAMPL技术比AFLP和SSR技术都更有效。在植物遗传多样性分析、连锁图谱构建和品种鉴定等方面有非常广阔的应用前景。SAMPL已被应用在针叶树、印度楝、印度人参、莴苣、普通小麦、甘蓝等植物上，但在不结球白菜上还未有应用。由于AFLP技术包括酶切和连接、预扩增、选择性扩增以及电泳等步骤，其体系相对于其他分子标记技术复杂，需要在不同的物种上选择不同的反应体系，尤其是引物不具有通用性，需要根据研究对象的基因序列进行设计和开发。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用SAMPL技术进行不结球白菜分子标记的方法，使其基于SAMPL技术的通用性原理，根据不结球白菜的特点，对SAMPL的复杂体系进行优化和引物设计，构建了适用于不结球白菜的SAMPL反应体系，从而实现不结球白菜分子标记。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括步骤如下：

①DNA(脱氧核糖核酸)提取；

②DNA酶切-连接体系的优化；

③SAMPL预扩增体系的优化；

④SAMPL扩增体系的优化、电泳、银染显色；

⑤聚类分析。

所述DNA提取，具体为：选取两叶期不结球白菜的一片真叶，利用CTAB法提取DNA，提取的DNA稀释到50-250ng·μL^-1，4℃保存备用。

所述DNA酶切-连接体系的优化，具体为：对DNA样品使用EcoRI、MseI或PstI酶中的一种进行酶切，并用T4-DNA连接酶把相对应的EcoRI、MseI或PstI的接头连接上去。采用26μL(微升)反应体系，分成两步：①13.5μL酶切反应体系包括2-5U(单位)的酶和50-250ng(纳克)的DNA，在37℃水浴3-8小时；②连接反应体系包括13.5μL酶切液、1-4pmol(皮摩)的EcoRI接头或PstI接头或者10-40pmol的MseI接头、0.2-1U的T4-DNA连接酶、2-8μmol(微摩)的ATP，在室温下(20℃左右)过夜。产物稀释一倍，-20℃保存备用。

所述SAMPL预扩增体系的优化，具体为：