[发明专利]新型标签蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种新型标签蛋白，所述的标签蛋白可以使用在原核和真核表达系统中，大量，经济，快速的获得具有高活性的同源重组蛋白质。

背景技术

在过去的研究中，一个庞大的与泛素相关的小分子蛋白家族Ubls(ubiquitin like proteins)相继被发现，包括了NEDD8，ISG15等，以及类似泛素的小修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier，SUMO)。

SUMO的同源物Smt3最早在酿酒酵母的遗传突变筛选中发现。在1996年，SUMO(Smt3)最早被发现能够共价地结合一个小G蛋白的激活蛋白RanGAP1，影响了此蛋白在细胞核与核质的运输，随后此类小蛋白被命名为SUMO，然后SUMO化修饰在多种生命过程，在多种生物体(酵母，昆虫，线虫甚至高等脊椎动物)中被发现，得到阐释。在低等的真核生物如酿酒酵母，昆虫，线虫中只有一种SUMO基因表达，在哺乳动物中已经发现4种，在植物中有8种之多。

在生物学研究和后基因组时代的研究中，研究一个基因的重要方面就是研究它在体外实验中的功能分析，要求能够方便快捷经济地实现重组蛋白质表达。然而，最为普遍使用的大肠杆菌表达系统中，人类基因组中只有约25％的基因能够正常表达、具有活性，大量的基因不能表达或者是形成包涵体(inclusion body)，即大量错误折叠丧失活性的目的蛋白在大肠杆菌菌体的不溶沉淀中，无法用于后续生化功能分析。为了获得所需的具有活性的目的蛋白，常用的方法有通过包涵体蛋白的变复性获得正确折叠的蛋白质，然而这种方法耗时耗力，并且具有很大的实验偶然性。因而最常用的方法就是使用促溶蛋白表达标签(tag)，比如葡萄糖亲和标签(maltose-binding protein MBP)，谷胱甘肽转移酶标签(glutathioneS-transferase GST)等，由于它们的促进翻译效率和帮助蛋白折叠的作用，极大的方便了目的蛋白的表达，纯化和检测。

除了上述的蛋白表达标签外，SUMO已经证明是最好的促溶蛋白表达标签之一。由于SUMO具有的高度类似泛素的桶状蛋白结构，具有相当的保守性，能够提供蛋白正确折叠的核心，极大提高了目的蛋白的溶解性。并且SUMO这个融合的蛋白标签可以在体外用源于酵母的SUMO特异的蛋白水解酶Ulp1极为高效的切割掉，从而获得与目的蛋白完全相同的重组蛋白质。

然而，在真核表达系统中，由于存在大量的内源的SUMO特异性的蛋白水解酶(如酿酒酵母中的Ulp1和哺乳动物细胞中的SENPn系列蛋白质)，SUMO蛋白标签会被迅速的切割掉，从而失去了作为蛋白标签所起的促溶和增进表达量作用，因而在真核系统中作用不显著。为了能够在真核表达系统中使用SUMO，将SUMO分为氨基端和羧基端结构域(NTHS和CTHS)两部分，将羧基端与目的蛋白融合，由于羧基端继承了SUMO的大部分保守蛋白结构域，具有甚至优于SUMO的促溶效果，并且无法被内源性的蛋白水解酶识别和切割，从而可以在真核系统中使用。在纯化好的SUMO羧基端融合的目的蛋白中，加入SUMO的氨基端蛋白分子，重组成为完整的SUMO分子，被外加的Ulp1c所识别，可以将融合的SUMO羧基端标签移除得到所需的目的蛋白。系统为Half SUMO互补表达系统，其一种操作流程例如图1所示。

在Half SUMO互补表达系统中，虽然能够在真核表达系统中使用SUMO蛋白标签，但是在去除蛋白标签的后续加工过程中，切割效率低下。

因此，本领域还有必要进一步研究改良的，更适合用于真核和原核表达系统的标签蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型标签蛋白及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述的标签蛋白表达目的蛋白的方法。

在本发明的第一方面，提供一种表达目的蛋白的方法，所述方法包括：

(a)提供一种构建物，从5至3依次含有以下可操作性相连的元件：亮氨酸拉链1的编码基因，类泛素分子羧基端区域的编码基因，和目的蛋白的编码基因(如置于适当的可对转录和翻译元件进行严格调控的载体中，例如pET28a-6His-Zipper-CTHS-EGFP和pM02-6His-Zipper-CTHS-EGFP)；

(b)将(a)的构建物转入宿主细胞，从而表达亮氨酸拉链1，类泛素分子羧基端区域和目的蛋白的融合蛋白，分离所述的融合蛋白；