[发明专利]一种位点特异整合性慢病毒载体系统及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种位点特异整合性慢病毒载体系统及其制备方法。

背景技术

慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒(human immunodefficiency virus，HIV)为代表.慢病毒不仅具有感染分裂靶细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。

基于I型人类免疫缺陷型病毒(human immunodefficiency virus，type1；HIV-1)的慢病毒载体目前已发展到第三代。第一代是复制缺陷型HIV-1的慢病毒载体，仅获得较低的重组滴度，且仅能感染CD4的靶细胞，并存在产生野生性HIV的严重危险。第二代慢病毒载体的一个重要改进，是采用了其它病毒的包膜蛋白基因代替HIV的包膜蛋白基因，构建成假型慢病毒载体(pseudotypelentivirus vector)。该载体含有水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)env蛋白G糖蛋白，使病毒颗粒非特异性地结合于靶细胞的膜磷脂，而不需要特异性膜受体。第三代慢病毒载体，缺失了与病毒包装和感染无关的序列，这些序列通常与病毒复制和致病性有关。第四代慢病毒载体，为自灭活性载体。该类载体将3-LTR中所有参与病毒复制的非必需序列缺失，使其经包装产生的子代重组病毒完全失去了复制能力，因而更安全。然而，同其它病毒如反转录病毒一样，慢病毒的整合是随机的，因而常导致插入突变之风险，该风险巨大阻碍着慢病毒载体系统在基因功能和基因治疗上的广泛地应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种位点特异整合性慢病毒载体系统，以克服慢病毒载体系统随机整合导致插入突变之风险，赋予该类载体系统位点特异整合功能；同时，通过改造包装载体，使该载体成为集有效性、安全性和操作简便性于一体的新型慢病毒载体。

本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。

本发明的再一个目的是提供一种位点特异整合试剂盒，用于将基因位点特异性整合在基因组中。

本发明提供了一种位点特异性整合慢病毒载体系统，由FattbC31UGW质粒、CMVΔ8.9-D64N/D116N和包膜质粒VSVG组成(其结构示意图分别如图1、2和3所示)；FattbC31UGW质粒是将attB位点序列和位点特异整合酶C31基因序列依次连接并且克隆到FUGW载体的PACI酶切点而得；CMVΔ8.9-D64N/D116N质粒是由CMVΔ8.9质粒中的pol基因D64N和D116N突变而得。

FUGW、pCMVΔ8.9(即CMVΔ8.9质粒)及VSVG来源于美国Carlos Lois博士惠赠。本发明的FUGW慢病毒载体来源于文章：Lois C，et al.Germlinetransmission and tissue-specific expression of transgenes delivered bylentiviral vectors.Science，2002，295：868-72。FUGW以除去有害基因后的HIV作为骨架，表达由泛素(Ubiquitin-C，UBC)调控的绿色荧光蛋白基因(EGFP)；pCMVΔ8.9为包装结构质粒，主要起病毒包装功能，表达酶蛋白形成病毒衣壳结构及整合酶(IN)；VSVG为包膜质粒。

一方面，包装载体CMVΔ8.9-D64N/D116N是由CMVΔ8.9中pol基因(其NCBI登陆号AAC54634)编码的HIV整合酶D64N和D116N双突变而成，使其仅有包装功能而未整合作用。另一方面，FattbC31UGW质粒是由attB位点序列和位点特异整合酶基因C31(即phi C31，其NCBI登陆号AX816372)序列克隆到FUGW载体的pacI酶切点而得到，赋予了该载体位点特异整合的功能。

新型慢病毒载体FattbC31UGW设计策略：FUGW载体与attB位点序列和位点特异整合酶基因phi C31的融合序列Attb-C31经PACI酶切，回收，连接而得到.如下图所示。

新型慢病毒包装载体CMVΔ8.9-D64N/D116N设计策略：编码HIV整合酶基因位于pol基因内，与整合有关残基被定向突变D64N/D116N，以此获得新型未整合活性低的慢病毒包装载体CMVΔ8.9-D64N/D116N如下图所示：