[发明专利]一个能辨别海带雌配子体的SCAR分子标记

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物性别鉴定的特异性分子标记，尤其涉及一种辨别海带雌配子体的SCAR分子标记。

背景技术

对于大多数植物来说，性别的鉴定主要是通过植物的外部形态、生理生化差异、同工酶图谱、特异蛋白、染色体组型、核酸等方面来进行的。随着分子生物技术的发展，特别是分子标记技术的日趋成熟，使得分子标记在植物性别鉴定中的作用显得越来越重要。因为分子标记能够直接从基因组DNA水平上来反映植物的差异，其测定过程不受植物发育阶段的影响，极大地提高经济效益。

自1974年Grozdicker等人首创第一代DNA分子标记——限制性片断长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)以来，各种分子标记如雨后春笋般地发展起来，到目前为止，已经发展到近几十种。如随机扩增产物多态性DNA(RandomlyAmplified Polymorphic DNA，RAPD)、简单重复序列[(Simple Sequence Repeat，SSR，又称微卫星(Microsatellite)序列)]、表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)、扩增的限制性片断长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、锚定简单序列重复(Inter-simple Sequence Repeat，ISSR)、单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)、单链构想多态性(Single-stranded Conformation Polymorphism，SSCP)等。这些标记技术在植物分子遗传图谱构建、遗传多样性分析与种质鉴定、重要农艺性状基因定位与图位克隆、转基因植物鉴定和分子标记辅助选择育种等方面发挥重要作用。目前，用于鉴定植物性别的分子标记主要有RAPD、SCAR、AFLP、SSR。

但是在藻类上利用分子标记鉴定其性别的报道非常少。Haring等利用衣藻(Chlamydomonas eugametos)性别相关的一些性状，构建了具有15个RAPD标记、3个形态学标记和1个RFLP标记的部分连锁图谱，为运用遗传图谱研究与性别相关的工作打下了基础。Martinez等利用RAPD来鉴定红藻门江蓠(Gracilaria gracilis)的性别，其中OPD13(5’-TCGTCACCCC-3’)一条引物就同时在江蓠雌、雄个体中扩增出两个差异片断，可应用于早期性别鉴定。

Paran首次提出序列特异性扩增区(Sequence characterized amplified region，SCAR)，通过对多态性RAPD产物进行克隆和测序，设计更长的引物将RAPD-PCR转变成经典的PCR可以提高稳定性、重复性和特异性。

目前，国内外未见关于辨别海带雌配子体的SCAR分子标记的报导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能海带雌酏子体的SCAR分子标记。

本发明根据地钱Y染色体保守区域设计引物(SEQ.ID.NO1)，对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，获得了一个与海带雌配子体性别相关的差异分子标记，通过胶回收、克隆、测序、引物设计及PCR等过程，进一步转化为SCAR分子标记(SEQ.ID.NO4)。该分子标记可用于海带配子体性别的快速有效鉴定、单性生殖海带孢子体亲本来源及其后代的性别鉴定。

本发明利用特别设计的引物(SEQ.ID.NO1)分别对海带雌、雄配子体中提取的基因组DNA进行PCR扩增。根据扩增产物的测序结果，将原引物SEQ.ID.NO1延伸为新的引物(SEQ.ID.NO3)。利用新的引物，再对海带雌、雄配子体基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物中得到一条大约为500bp的特异条带(见图2所示)，此谱带仅在海带雌配子体基因组扩增中出现，而在海带雄配子体基因组扩增中没有此条带出现。经测序，该海带雌配子体特异条带的大小为494bp，记为F-494，作为海带雌配子体特异性分子标记，序列为SEQ.ID.NO4。

本发明提出的辨别雌配子体的SCAR分子标记的获取方法如下：

(1)在17±1℃、30-40μmol m^-2s^-1光照条件下培养海带雌、雄性配子体无性繁殖系，收集材料并提取配子体基因组DNA。