[发明专利]一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及培养基技术领域，更具体地，涉及用于培养海洋灰绿曲霉的培养基技术领域，特别是指一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基及其制备方法。

背景技术

现在从陆地生物中发现新化合物越来越难，相反海洋是目前开发极少的巨大生物资源宝库。最近几年从海洋生物特别是无脊椎动物、微生物中分离出了大量新型生物活性物质，统计表明2003年报道了656种新化合物，2004年报道了716种新化合物。其中部分处于I-III期临床实验。海洋微生物，包括海洋放线菌、真菌等是新活性物质的重要来源。

灰绿霉素A(aspergiolide A)是中国海洋大学从海洋真菌灰绿曲霉HB1-19(Aspergillus glaucus HB1-19)中分离出来的一种具有自主知识产权的、结构全新的具有抗癌活性新蒽酮内酯化合物。灰绿霉素A以9-蒽酮为母核，利用SciFinder数据库进行相似化合物检索，未搜到该类9-蒽酮内酯衍生物，这说明灰绿霉素A结构骨架较为新颖。经中科院上海药物所评价，其对人肺癌A549细胞、人白血病HL60细胞有较强的增殖抑制作用，其IC₅₀分别为0.13和0.28μM。此外该化合物在10^-6M浓度下，对人脐静脉内皮细胞具有明显的增殖抑制作用和迁移抑制活性，具有良好的开发价值。

新药开发的历史证明，有些天然活性产物如青霉素等不仅本身可直接被开发成新药产品，而且还成为研制后续系列新药产品的重要先导物；即使是本身不宜直接开发的新天然活性产物，往往也会为创新药物研究提供新的活性先导结构，供进一步结构改造和优化。由于灰绿霉素A结构具有新颖性并且展示很好的抗癌活性，所以非常有必要对其进行深入研究。

然而灰绿霉素A在原始菌株中含量极低(＜15mg/L)，制约了对其进行进一步的体内外活性评价及构效研究，因此通过规模化发酵及代谢调控研究，进行高效发酵生产是必须加以解决的首要问题。而要进行大规模高效发酵生产和代谢调控研究，继而进行后续的医药学研究，首要解决的就是产量问题，所以开发一种促进海洋灰绿曲霉生产灰氯霉素A的培养基就成为后续研究的一个非常重要的前提条件。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基及其制备方法，该新型培养基原料易得、成本低、制备方法简单、能显著促进海洋灰绿曲霉HB1-19发酵生产灰绿霉素A的产量，有利于大规模工业化生产，对海洋灰绿曲霉发酵研究及灰绿霉素A医药学研究具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于海洋灰绿曲霉生产新型抗肿瘤活性化合物的新型培养基，其特点是，每升所述新型培养基包括：可溶性淀粉20～100g，蔗糖10～100g，麦芽糖20～100g，蛋白胨0.5-6g，酵母膏0.3-6g，黄豆粉0.2-4g，谷氨酸钠0.5-10g，七水硫酸镁0.01-1g，磷酸二氢钾0.01-2g，其余为人工海水。

较佳地，所述可溶性淀粉40g，蔗糖40g，麦芽糖30g，蛋白胨2g，酵母膏1.07g，黄豆粉1g，谷氨酸钠2g，七水硫酸镁0.03g，磷酸二氢钾0.05g。

较佳地，每升所述人工海水包括：氯化钠24.5g，无水硫酸钠3.92g，无水氯化钙0.91g，六水氯化镁4.98g，硼酸0.026g，氯化钾0.664g，溴化钾0.096g，碳酸氢钠0.192g，其余为去离子水。

一种用于制备上述的新型培养基的方法，其特点是，包括步骤：

a.所述可溶性淀粉用部分所述人工海水进行糊化，冷却；

b.所述蔗糖，所述麦芽糖，所述蛋白胨，所述酵母膏，所述黄豆粉，所述谷氨酸钠，所述七水硫酸镁和所述磷酸二氢钾溶于部分所述人工海水；

c.将上述两步骤得到的溶液混合均匀，用所述人工海水定容。

上述步骤a中，所述可溶性淀粉需先用人工海水糊化，目的是防止灭菌过程中结块的问题。

较佳地，在步骤a中，所述糊化为用部分所述人工海水将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-100℃的人工海水中并不断搅拌，至成半透明状液体。

较佳地，步骤c进一步包括：在121℃，灭菌20～40min。

一种使用上述的新型培养基培养海洋灰绿曲霉HB1-19生产灰绿霉素A的发酵方法，其特点是，包括步骤：取海洋灰绿曲霉HB1-19孢子接种所述新型培养基进行培养，获得新鲜接种液，取所述新鲜接种液按10～15％的接种量接入新鲜的所述新型培养基进行发酵培养6-9天，获得发酵液。