[发明专利]重组极端耐热α-淀粉酶的复性与纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种嗜热α-淀粉酶的重 组表达与制备方法。

背景技术

α-淀粉酶是工业上最常用的酶制剂之一，广泛应用于食品、纺织、化工工 业以及发酵工业中的淀粉加工。寻求与开发耐受高热的淀粉酶长期以来始终是 工业酶研究领域的重点与热点课题。对于淀粉酶耐热性，生产产率以及酶活性 的任何提高均具有十分重要的理论意义与直接商业价值。

目前已经发现了多种嗜热α淀粉酶。例如，获自嗜热古菌(Pyrococcus furiosus)的α-淀粉酶PFA；获自火球菌属的嗜热α-淀粉酶、获自沃氏火球菌 (Pyrococcus woesei)的嗜热α-淀粉酶等等。P furiosus是从海底火山温泉中分离 得到的绝对厌氧菌，最适生长温度100℃，培养相对较为复杂，难以实现大规 模工业培养，PFA的较大量制备只能通过外源重组表达方能够实现。至今尚未 有适宜于该酶的较大规模的制备方法的公开报道。

目前多家实验室在大肠杆菌及酵母中进行了α-淀粉酶的重组表达研究，但 表达量均较低。以往的研究思路主要偏重于提高其可溶性的表达，包括采用低 温诱导，以提高重组蛋白质可溶性表达的策略，从菌体破碎上清中纯化得到该 重组蛋白；以及采用与Intein融合表达的方式，提高了蛋白可溶性表达量等方 法，但总的表达量仍不高。

本发明人在以往的工作中也致力于重组PFA的重组表达研究，尝试采用了 与现有技术思路不同的研究策略，即首先实现重组PFA蛋白质分子的大量与高 效表达，即使是以不溶性的包涵体形式，之后再研究采用合适的纯化复性方法 以获得较高活性的重组酶。以往的研究中，本发明人已经建立碱变性-加热-稀 释复性的纯化方法，较高效率地纯化获得了具有较高生物活性重组PFA。然而， 碱变性-加热-稀释复性方法存在的问题是对操作条件要求高，对温度和PH具有 严格的要求。

综上，本领域还需要进一步研究改进嗜热α-淀粉酶表达的策略，提供简便、 高效、低成本、易于放大的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种嗜热α-淀粉酶的制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种嗜热α-淀粉酶的制备方法，它包括步骤：

(1)用去垢剂溶液溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体，从而获得含嗜热α-淀粉酶 的溶液；和

(2)从(1)获得的溶液中分离出所述的嗜热α-淀粉酶。

在另一优选例中，所述的嗜热α-淀粉酶选自：火球菌属(Pyrococcus)的嗜 热α-淀粉酶、嗜热古菌(Pyrococcus furiosus)的嗜热α-淀粉酶(PFA)、沃氏火球 菌(Pyrococcus woesei)的嗜热α-淀粉酶或来源于其他嗜热微生物的嗜热α-淀 粉酶。

在另一优选例中，所述的去垢剂是离子型去垢剂。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括：利用原核表达系统表达嗜热α -淀粉酶，从而获得嗜热α-淀粉酶的包涵体。

在另一优选例中，原核表达系统是大肠杆菌。

在另一优选例中，用于表达嗜热α-淀粉酶的表达载体为pT7473或 pET21a。

在另一优选例中，在步骤(1)中，所述的去垢剂选自：十二烷基磺酸钠(SDS) 或十二烷基肌氨酸钠(SLS)。

在另一优选例中，所述的去垢剂溶液中去垢剂的浓度按照重量体积比(w/v) 是0.01-10％；较佳的是0.02-5％；更佳的是0.1-3％；进一步更佳的是0.1-1％； 如0.15％，0.2％，0.3％，0.5％，0.8％。

在另一优选例中，所述的去垢剂溶液含有：按照重量体积比0.01-10％的去 垢剂和缓冲溶液。

在另一优选例中，所述的缓冲液是醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液或磷酸 盐缓冲液。

在另一优选例中，在步骤(1)中，去垢剂溶液溶解嗜热α-淀粉酶的包涵体 的时间是1-200分钟；较佳的是10-100分钟；如40分钟、60分钟、80分钟。

在另一优选例中，所述的去垢剂溶液的PH值是2.5-10.0；较佳的PH值是 4.0-7.0。

在另一优选例中，在步骤(2)中，采用疏水层析法从含嗜热α-淀粉酶的溶 液中分离嗜热α-淀粉酶。