[发明专利]一种提高肽段离子化效率的方法

说明书

技术领域

本发明属生化分析领域，涉及一种提高肽段离子化效率的方法。具体涉及利用碱性和疏水性有机化合物对多肽和蛋白样品的羧基进行衍生，使得其质谱离子化效率得到提高，并对所衍生的样品直接进行质谱分析和鉴定。

背景技术

伴随着人类基因组计划(HGP)的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。现阶段，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能，与在基因组整体水平上阐明基因活动的规律相比，任务更为复杂，也更加艰巨。

本领域公知，蛋白质组学研究包括样品或组织中的蛋白质分离和鉴定两个关键步骤。随着新的软电离方式——基质辅助激光解析电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)的产生，生物质谱已经成为蛋白质组学技术平台中最为重要的技术手段之一。蛋白质组是一个在时间和空间动态变化着的整体，样品体系极其复杂，蛋白动态分布范围非常广。与疾病和信号传导相关的蛋白质往往属于低丰度的蛋白质，这些重要的蛋白质由于本身存在的量极少而很难得以有效鉴定，而样品中广泛存在的翻译后修饰特别是磷酸化修饰由于其本身离子化效率低和容易受到非磷酸化肽段的压制等原因，使得对于磷酸化肽段和蛋白质的直接鉴定存在着很大的困难。

随着蛋白质组研究的进一步拓展和深入，尤其是对磷酸化修饰等难电离肽段和低丰度蛋白质的分析鉴定对质谱离子化技术提出越来越高的要求。现有的针对难电离磷酸化肽段的方法主要是对于磷酸化肽段进行特异性富集，比如采用IMAC，TiO₂等富集材料选择并浓缩磷酸化肽段，从而达到去除非磷酸化肽段的压制以及提高浓度的目的。然而，这些方法的特异性并不够高，步骤繁琐，耗时也长，大大增加了样品损失、污染的可能性，并不适用于高通量的蛋白质鉴定。而对于低丰度蛋白质，富集仍然是最主要的方法，而这种方法需要大量的样品做支持，且高丰度蛋白质的压制也很难去除，导致对其的质谱检测目前仍然没有很好的改善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从根本上提高肽段质谱离子化效率的方法。具体涉及一种通过肽段羧基衍生提高肽段离子化效率的方法。本方法操作简单、灵敏度高、重现性好、经济、省时、适应于高通量蛋白质组学研究要求，能对磷酸化肽段或低丰度蛋白质直接进行质谱分析。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

1、利用碱性和疏水性有机化合物，对多肽或蛋白质样品(简称：肽段)的羧基进行衍生，实现提高多肽质谱离子化效率，其特征是通过下述方法和步骤：

1)将碱性和疏水性有机化合物、肽键缩合试剂和催化剂分别溶解于有机溶剂中，所述三种试剂按顺序依次加入所述的肽段水溶液中形成反应体系，用酸调节pH值7.5～7.8，将上述反应体系置室温下混悬；

2)去除上述反应体系中的所述的溶剂，终止衍生反应，得衍生产物；

3)将上述衍生产物溶解，直接用于MALDI-MS或ESI-MS检测。

本发明所述的多肽和蛋白质样品的羧基包括碳末端羧基和酸性氨基酸侧链羧基。

本发明所述的碱性和疏水性有机化合物是含嘧啶基的化合物，选自2-肼基嘧啶，1-(2-嘧啶基)哌嗪，4-氨基-2-(1-哌嗪基)嘧啶或4-氨基-6-氯嘧啶。

本发明所述的肽键缩合试剂选自N，N-二环己基碳二亚胺、N，N-二异丙基碳、二亚胺1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或碳酰二咪唑。

本发明所述的催化剂选自1-羟基苯并三唑、6-氯-1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑。

本发明所述的酸采用三氟乙酸、盐酸、甲酸或乙酸等酸。

本发明通过去除反应体系中的溶剂达到终止反应的目的，采用室温自然干燥、烘干、真空干燥或氮气吹干等手段去除反应溶剂。

本发明直接将衍生产物用含5％乙腈0.1％甲酸的水溶液溶解用于电喷雾离子源质谱检测，或将衍生产物用含50％乙腈0.1％三氟乙酸的水溶液溶解用于基质辅助激光解吸离子源质谱检测。

本发明方法通过碱性和疏水性有机化合物改变肽段中带负电、亲水性的羧基从而有效改变了肽段的性质，使其电离效率得到提高，大大提高了其质谱检测灵敏度。例如对于磷酸化肽段(TPpTAPSLG)，经过衍生后离子化效率提高了101倍。