[发明专利]钠磷转运体DvSPT2基因诱导型启动子、其克隆方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种钠磷转运体DvSPT2基因诱导型启动子、其克隆方法及其应用。

背景技术

磷元素是植物维持正常生理功能所必需的大量营养元素之一，对于农作物来说磷肥也是最重要的肥料。但是由于磷在土壤中的低溶解性及高附着性，土壤中可供植物利用的磷浓度通常是1μmol/L甚至更少。据估算，全球每年有多达57亿公顷的土地因为缺磷而导致农作物减产。另一方面，盐碱化是农作物面临的另外一个重要不利因素，全球20％的耕地正在受到盐碱化影响，严重影响了粮食产量。面对当今日益严重的粮食短缺问题，研究植物对低磷和高盐胁迫的耐受机制，采用基因工程手段提高农作物对低磷和高盐胁迫的耐受能力是一项具有重大意义的工作。

盐藻(Dunaliella)是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，是已知的最耐盐的真核生物，广泛分布于盐湖、海洋、盐土等高盐度的环境中。盐藻具有十分惊人的渗透调节能力，通过高效调节细胞内甘油的变化，能在低至50mM高至接近饱和的盐浓度的环境下生存，可以一次性耐受3-4倍的渗透压变化。此外，它对光照、环境pH、温度、营养限制如磷饥饿等其他胁迫因素也能够很好的耐受，因而被广泛的用来研究植物对各种胁迫的反应机制。研究证明，生长在μmol/L级别磷浓度环境中的盐藻，可积累高达500mmol/L的胞内磷浓度。盐藻对磷元素的高效吸收不仅满足了其对磷元素的一般营养需求，同时也对其合成甘油，抵抗渗透胁迫具有重要的意义。在盐藻中，高亲和性的钠磷转运体参与了磷元素选择性的跨膜主动运输，为在高盐条件下有效地利用磷元素发挥了重要的作用。对于这类和高盐以及磷代谢密切相关的基因及其调控元件的研究有助于推动农作物的改良工作。

另一方面，除了作为抗逆研究的模式植物，盐藻也是一种具有多种优点的新型生物反应器。利用盐藻作为生物反应器，培养成本低廉，经转基因表达外源产物不需要经过复杂的后续修饰加工，而且在盐环境培养下的盐藻不易污染其他微生物，安全性高。开发盐藻做为生物反应器生产外源生物活性物质正在成为研究的热点。目前，在转基因的生物反应器中大多采用诱导型启动子来控制目的基因的表达。因为诱导型启动子能够使目的基因在特定的时期和特定的部位表达，这样可以使宿主细胞对特定的外界信号作出反应，又可以避免目的基因的过高表达对宿主细胞生长带来的不良影响。在这方面，采用盐藻内源性启动子具有可靠的安全性，特别是受盐信号，营养因素信号诱导的启动子，不需要化学诱导，无毒副作用，且在生产过程中控制方便。

因此，克隆和分析盐藻钠磷转运体基因的诱导型启动子不仅能为高等植物的改良工作提供帮助，而且也为盐藻生物反应器的开发提供了重要的工具。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个钠磷转运体DvSPT2基因诱导型启动子的核苷酸序列。

本发明目的之二是提供该DvSPT2基因启动子的克隆方法。

本发明目的之三是提供了该DvSPT2基因启动子在盐胁迫以及磷缺乏条件下的基因调控作用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种钠磷转运体DvSPT2基因诱导型启动子，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：

(1).具有SEQ NO 1所示的DNA序列；

(2).与序列表中序列1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

一种上述的钠磷转运体DvSPT2基因诱导型启动子的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

A.根据NCBI GenBank上DvSPT2的cDNA序列，即DQ286761，设计引物，引物的序列如下：

5′-AGAACCTGAGCGGCTTCATC-3′

5′-CACGCAGCAATGAAGGAGGT-3′

通过四维PCR筛选体系从盐藻基因组BAC文库得到一个含有盐藻钠磷共转运通道2号基因DvSPT2的BAC克隆，并构建该BAC克隆的鸟枪文库；

B.大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定，每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序；