[发明专利]高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种高灵敏免疫胶乳定量比浊测定试剂，尤其是涉及该试剂的 制备方法。

背景技术：

自上世纪80年代开发出直径小于200纳米的颗粒可作为免疫载体的均相化 试剂以来，已开发出许多免疫测定项目，其优点如下：一是由于颗粒直径小于 光波长的2/5，既可作为免疫物质载体，又不失为均相化试剂，在自动化定量操 作上具备明显的优势；二是免疫物质的固相化，降低被载物质抗原或抗体的自 由能，明显延长该物质免疫抗原或抗体活性，由于上述优势，目前已经有多个 免疫检测项目利用该技术成功研制出相当优秀的诊断试剂产品。但其不足之处 是在灵敏度上不及酶标记和荧光标记方法，对于含量甚低的蛋白原分子不能该 方法所检测，对于激素、药物类型小分子不能形成有效的免疫结合网络，故也 不能用该方法检测。同样，在使用单克隆抗体上也有一定困难，需要多个单克 隆抗体配组使用。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术不足之处而提供一种能对含量甚低的蛋白原 分子作检测的、对于激素、药物类型小分子能形成有效的反向免疫结合网络的 高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的制备方法。

本发明的目的是通过以下措施来实现：一种高灵敏免疫定量胶乳测定试剂 的制备方法方法，其特殊之处在于：

高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的组成：

R₂：微球粒浓度按重量百分比计0.2～0.4％，0.12M甘氨酸缓冲液pH7.2， 乙二醇按体积百分比计30％，2mM EDTA·2Na乙二胺四乙酸二钠盐，0.1％NaN₃

其制备经过下列步骤制备：

(1)载体免疫定量胶乳微颗粒的的制备纯水，经加热至沸腾后除去水中 绝大部分氧气，经冷却后取750ml加入1.0g十二烷基磺酸钠SDS在65℃恒温 10分钟，待SDS呈悬浮溶液状态后加入含量大于98％的苯乙烯单体30ml，再 将温度上调至75℃，平衡15分钟后加入丙烯酸5.2ml pH调节至5.5-6.5，平衡后 加入过硫酸钾，开始计时并逐渐升温至84℃，反应时间为30分钟，按微颗粒球 大小表面羧基量的4倍分二次加入已中和的丙烯酸使微球表面全羧化为止，在 84℃老化两小时，自然冷却；

(2)抗体、抗原的制备：由市购采得，按重量体积百分比计33％硫酸铵 饱和沉淀纯化抗体；

(3)常温下在前述微颗粒球液中按1％浓度含有效羧基量为0.005mM计加 入水溶碳化二亚胺EDC，0.005*192*40％mg量，在pH＜6.5条件下活化20分 钟，将pH上调至7.0-7.2，加入正氨基己酸0.005*132*60％mg量，在室温下作 用2小时将pH上调至7.5，在4℃过夜，次日对0.025M，pH7.0的NaCL溶液 透析两次，备用；

(4)将上述已伸手臂的微球液按0.005*192*15％mg量加入EDC，活化20 分钟后，加入50％体积的乙二醇，并将pH上调至7.0-7.2，平衡后快速倒入抗体 液，在室温下作用2小时，同时控制pH不低于7.0，置于4℃平衡过夜；次日， 将pH调至7.0，再置于4℃平衡过夜；48小时后，按2.0mg/1％·ml的比例加入 牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白溶于0.025M，NaCl，pH6.8，封闭过夜，最 后补加甘氨酸，乙二醇，NaCl，使其最终浓度达到0.12M，30％，0.1％，pH7.4； 在4℃中储存3日后待用。

(5)完成制备。

与现有技术相比，由于采用了本发明提出的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂的 制备方法，提高了载体微颗粒直径的均匀度及抗原或抗体在颗粒表面分布的均 匀度，同时还使包被的抗原或抗体在均相条件下的自由度增加，减少空间结合 位阻，增加二级免疫反应速率，提高反应灵敏度，其检测的灵敏度比以往文献 报道可提高100倍。

具体实施方式

本发明制备的高灵敏免疫定量胶乳测定试剂用下列步骤制备：