[发明专利]牛基因组假attP位点及其应用

权利要求书

1.一种分离的牛基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA片段，其特征在于，其 为牛基因组假attP位点核心序列，该片段DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种分离的牛基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA片段，其特征在于，该 片段由牛基因组假attP位点核心序列和旁侧序列组成，该片段DNA序列如SEQ ID NO.2 所示，该牛基因组假attP位点核心序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种定向整合牛基因组假attP位点的载体，其特征在于，所述载体包括目的基因， 假attP位点旁侧序列，attB位点核心序列；其由下述方法构建所得：

a、从假attP位点两边旁侧序列扩增4.7kb的片段，该片段由假attP位点核心序列和 旁侧序列组成，所述的假attP位点核心序列及其旁侧序列是如SEQ ID NO.2所示的DNA 序列，所述的假attP位点核心序列如SEQ ID NO.1所示；

b、切除步骤a片段中假attP核心序列后，连上338bp的attB序列，所得片段与目的 基因相连接，其中所述338bp的attB序列来自对pEGFP-N1-attB的AflII酶切产物走0.8％ 的琼脂糖凝胶电泳回收得到的338bp的片段。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述目的基因选自绿色荧光蛋白、人第 九凝血因子、人血清白蛋白和人转铁蛋白。

5.一种在牛细胞中整合目的基因的方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求3所 述载体和含链霉菌噬菌体ФC31整合酶基因的质粒按一定比例混合后转染牛细胞，然后筛 选阳性克隆细胞株。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤中权利要求3所述载体和含链 霉菌噬菌体ФC31整合酶基因的质粒的质量比为10∶1。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤采用脂质体介导的细胞转染法。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述牛细胞为牛耳皮肤成纤维细胞。