[发明专利]牛基因组假attP位点及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于牛基因组中能被链霉菌噬菌体ΦC31 整合酶识别的假attP位点及其应用。

背景技术

哺乳动物细胞中导入外源基因的方法有很多种，物理方法主要有：受精卵原核显微注 射法、电穿孔法；化学方法主要有：磷酸钙-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体介 导法及生物学的病毒介导方法等等，但所有的外源基因导入方法均涉及到外源基因的随机 整合及表达的问题，外源基因整合位点的随机性将给目的基因及宿主细胞带来不可预知的 后果：1、外源基因的随机整合可能会造成位置效应影响，导致目的基因表达水平的不稳 定甚至不表达；2、对宿主细胞的基因组而言，外源基因的随机性插入可能激活或抑制某 些内源基因，改变其原先正常有序的基因表达调控模式，致使细胞癌变甚至死亡。

位点特异性重组是自然界中实现遗传物质重组的另一种形式，指在噬菌体整合酶的作 用下，噬菌体基因组与细菌基因组在约几十个特定的碱基之间发生的重组反应。人们利用 这一特定的整合方式而实现外源基因在哺乳动物基因组中进行定点修饰。Cre酶及Flp酶 是目前在哺乳动物基因组修饰中较为常用的两种酶。尽管存在着一些局限如外源基因在整 合后还可能解离反应，即已整合的外源基因在重组酶的作用下从染色体上切除等，这两种 酶广泛地被运用于基因组的精确修饰(Nagy A，Genesis.2000 Feb；26(2)：99-109)(Nagy A， Methods Mol Biol.2001；158：95-106)(Kolb A F，Cloning Stem Cells.2002；4(1)：65-80)。

一种来源于ΦC31链霉菌(Streptomyces)噬菌体的整合酶即ΦC31整合酶，由于它是 以单向整合方式，重组过程无须其他辅助因子，而且整合率高的特点，所以近年来越来越 多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合。在自然界中ΦC31整合酶介导噬菌 体基因组中39bp的attP位点(attachment site in phage genome)与细菌基因组中34bp的 attB位点(attachment site in bacteria genome)发生特异性整合，ΦC31整合酶分别切断attP 位点及attB位点的核心序列，在链发生交换后，四条链的末端重新连接，这样噬菌体基因 组被稳定整合入细菌基因组中，噬菌体基因组的左右两端分别是两个杂合的短序列：attL、 attR(Thorpe HM，Proc Natl Acad Sci U S A.1998 May 12；95(10)：5505-10)(Groth AC，Proc Natl Acad Sci U S A.2000 May 23；97(11)：5995-6000)。因为与其他的重组酶如Cre酶及Flp 酶不同，ΦC31整合酶介导的整合是单向性，它不会发生回复切除，即当attB、attP两序 列发生特异性重组后，所产生的attL和attR不会被ΦC31整合酶识别而被再次介导重组 (Thorpe HM，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1998 May 12；95(10)：5505-10)(Groth AC，Proc. Natl.Acad.Sci.U S A.2000 May 23；97(11)：5995-6000)，这样的整合显得有效、稳定。而 且，ΦC31整合酶介导的重组过程中无需其他辅助因子，这些优点使ΦC31整合酶在生物 工程上具有重要的利用价值，有研究发现，ΦC31整合酶在哺乳动物中能有效介导携带有 attB序列的外源基因与哺乳动物基因组发生高效重组反应，实现位点特异性整合 (Thyagarajan B，Mol.Cell Biol.2001 Jun；21(12)：3926-34)。事实上，ΦC31整合酶介导的 重组反应，广泛地被运用于诸多领域，包括转基因动物制备、基因治疗、基因组修饰等 (Nimmo D D，Mol.Biol.2006 Apr；15(2)：129-36)(Allen BG，Nat.Protoc.2006；1(3)： 1248-57)(Bertoni C，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2006 Jan 10；103(2)：419-24)(Bateman J R， Genetics.2006 Jun；173(2)：769-77)(Ehrhardt A，Mol Ther.2007 Jan；15(1)：146-56)。