[发明专利]一种乙醇酸氧化酶制剂、制备方法及应用

权利要求书

1.一种乙醇酸氧化酶制剂，其特征在于：所述的乙醇酸氧化酶是采用硫酸铵沉淀法自黄花苜蓿植物破碎液中提取获得的可催化氧化乙醇酸生成乙醛酸的乙醇酸氧化酶。

2.如权利要求1所述的乙醇酸氧化酶制剂，其特征在于：所述的乙醇酸氧化酶的等电点pI＞9.0，反应的最适pH与反应温度分别为9.0和15℃，表观米氏常数K_m与V_max分别为0.138mmol/L和0.173mmol·min^-1/g蛋白。

3.一种如权利要求1所述的乙醇酸氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的乙醇酸氧化酶采用如下(1)或(2)步骤分别获得乙醇酸氧化酶的粗酶粉制剂或磁粉固定化酶制剂：

(1)乙醇酸氧化酶粗酶粉制剂：

将新鲜黄花苜蓿叶片破碎、离心，收集上清液，缓慢加入硫酸铵粉末待完全溶解后，继续缓慢搅拌30min，收集沉淀的蛋白质，加入适量乳糖作为冻干保护剂，冷冻干燥后制得粗酶粉制剂；所述的上清液与硫酸铵的重量比为1∶(0.1～0.6)；蛋白质与乳糖的重量比为1∶(0.5～2)；

(2)磁粉固定化乙醇酸氧化酶制剂：

将新鲜黄花苜蓿叶片破碎、离心，收集上清液，缓慢加入硫酸铵粉末，收集沉淀的蛋白质，溶解于pH为6～9的缓冲液中，透析除去硫酸铵，然后加入磁性纳米颗粒作为固定化载体，通过吸附和洗涤制成磁粉固定化酶制剂；所述的上清液与硫酸铵的重量比为1∶(0.1～0.6)；蛋白质和缓冲液重量比为(1～5)∶1000；透析时间5～12h；透析膜孔径12000～14000Da。

4.如权利要求3所述的乙醇酸氧化酶制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)进行硫酸铵沉淀酶时，所加硫酸铵的量为10％～70％的饱和度；所述的缓冲液是磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的磁性纳米颗粒固定化载体为用水热合成法制备所得的氨基化磁性纳米颗粒；酶蛋白质与磁性载体的重量比为1∶(10～100)，固定化温度为15℃～30℃，固定化时间为12～24小时。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是所述磁性纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

将1，6-己二胺的含量为8～12％(w/v)、无水乙酸钠的含量为9～15％(w/v)和FeCl₃·6H₂O的含量为2～5％(w/v)的乙二醇溶液于170～250℃静置反应4～10小时后生成的黑色沉淀的磁性纳米颗粒，依次用热水和乙醇反复洗涤，烘干，备用。

7.一种如权利要求1所述的乙醇酸氧化酶制剂应用于催化氧化乙醇酸制备乙醛酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的制备为：在50mM～1000mM的pH为7.0～10.0的乙醇酸溶液，加入如权利要求3(1)或(2)所述的乙醇酸氧化酶制剂，在10～35℃反应0.2～72h；其中，基于底物量的乙醇酸氧化酶制剂使用量为10～100U/mol乙醇酸。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：在制备时添加适量的乙二胺、黄素单核苷酸以及过氧化氢酶，乙二胺与乙醇酸的摩尔比为：(1～1.2)∶1；黄素单核苷酸的浓度为0.01～0.1mM；过氧化氢酶的添加量为(1～10)×104U/ml。