[发明专利]一种乙醇酸氧化酶制剂、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂、制备方法及其用于催化乙醇酸氧化生产乙醛酸的应用。

背景技术

乙醛酸(Glyoxylic acid，GA)，又名二羟醋酸、甲酰甲酸，是最简单的醛酸，分子中包含醛基和羧基两种功能基团，因而兼有醛和羧酸的双重特性，可同时发生醛、酸的反应，有时还会发生环化反应，是一种重要的有机合成中间体。从乙醛酸出发，可以衍生出几十种有广泛用途的精细化工产品，广泛应用于香料、医药、农药、食品添加剂等行业中。随着乙醛酸应用范围的扩大及后继产品的开发，其市场容量不断加大，对产品的质量提出更高的要求。加速研制、开发乙醛酸及其系列产品，对发展我国的乙醛酸工业具有重要的意义。

乙醛酸的合成方法包括化学合成法与生物合成法。工业上最常用的化学合成法有草酸电解还原法、乙二醛硝酸氧化法、马来酸(酐)臭氧化法。一般而言，化学合成法工艺复杂，生产成本高，能耗大，并且有较严重的环境污染。以乙醇酸为底物，用乙醇酸氧化酶作为生物催化剂，进行乙醇酸生物转化合成乙醛酸的生物合成法是现今乙醛酸生产的研究热点，与化学合成法相比，具有能耗低，副产物少，环境污染小，产物的后续分离相对简单等独特优点。随着环保措施的不断加强，通过生物法合成乙醛酸是一种必然趋势。

到目前为止，在生物法合成乙醛酸的研究中，使用的酶制剂主要是基因工程重组的菠菜乙醇酸氧化酶。例如，文献J.Org.Chem.，1993，58：2253-2259报道：美国杜邦公司使用游离菠菜乙醇酸氧化酶作为催化剂，在过氧化氢酶以及FMN、乙二胺等添加剂的存在下，催化乙醇酸氧化合成乙醛酸。由于游离菠菜乙醇酸氧化酶的稳定性较差，反应需在低温(15℃)下进行，游离酶无法重复使用。反应完毕后，通过对反应液加热处理，使游离乙醇酸氧化酶变性沉淀，离心去除酶的沉淀后，才能从上清液中提取产物乙醛酸。

其后，杜邦公司直接使用含有酶的重组微生物细胞作为催化剂，催化乙醇酸氧化合成乙醛酸[J.Org.Chem.，1995，60：3957-3963]，反应完毕后，整细胞催化剂可以回收重复使用。由于存在较严重的细胞壁通透障碍，整细胞催化剂在使用前必须用化学试剂进行通透处理，考虑到酶的稳定性，反应仍然需在低温(5℃)条件下进行。

低温反应需要额外消耗能量，为了提高酶的温度稳定性，有必要对酶进行改造或进行固定化。菠菜乙醇酸氧化酶的固定化已有专利报道(David L.Anton，et al.US Patent 005,439,813A)，选用的载体是环氧树脂，酶活力回收率低，仅为17％，而且商品化的环氧树脂价格昂贵，不适于大规模生产应用。

本发明针对以上局限，通过广泛筛选，发现植物黄花苜蓿(俗称“草头”)中存在高活力的乙醇酸氧化酶，这种植物的乙醇酸氧化酶尚未见文献报道。与菠菜乙醇酸氧化酶相比，黄花苜蓿乙醇酸氧化酶性能优良，原料充足，酶的提取简便，是生物合成乙醛酸的良好生物催化剂；我们还进一步开发了一种简便、低成本且高效率的酶固定化方法，使用自行制备的纳米磁粉材料，通过简单的物理吸附方法即可很容易地实现乙醇酸氧化酶的固定化；在酶催化反应完成后，使用磁铁即可可以很容易地进行固定化酶的回收，并且进行重复使用，工艺过程非常简单，经济成本也相对较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂；

本发明的目的还提供一种上述黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂的制备方法；

本发明的另一目的是提供一种上述黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂.

本发明的乙醇酸氧化酶制剂是采用硫酸铵沉淀法自黄花苜蓿植物破碎液中提取获得的可催化氧化乙醇酸生成乙醛酸的乙醇酸氧化酶。所述的乙醇酸氧化酶的等电点pI＞9.0，反应的最适pH与反应温度分别为9.0和15℃，表观米氏常数K_m与V_max分别为0.138mmol/L和0.173mmol·min^-1/g蛋白。

根据乙醇酸氧化酶是高等植物光呼吸途径中的关键酶这一特征，本发明人对多种具有较强光呼吸的C₃植物进行了乙醇酸氧化酶含量与活力的比较。

本发明的乙醇酸氧化酶筛选方法简述如下：

(1)初筛：称取相同重量的不同种类C₃植物的新鲜叶片，加入预冷的缓冲液，研磨获得植物细胞破碎液，测定破碎液中乙醇酸氧化酶活力以及蛋白质含量。