[发明专利]一种获得角膜内皮样细胞的方法及体外构建角膜后板层

权利要求书

1.一种诱导形成角膜内皮样细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将2-8×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞(bone marrow derived endothelial progenitorcells，BEPCs)和0.6-3×10⁵个/ml的角膜内皮细胞(coneal endothlial cell，CECs)共培养，使骨髓内皮祖细胞分化形成角膜内皮样细胞；优选将3-7×10⁴个/ml的骨髓内皮祖细胞和0.8-1.2×10⁵个/ml的角膜内皮细胞共培养。

2.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，共培养中所使用的培养液是含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM；共培养7-14天；优选8-10天。

3.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的骨髓内皮祖细胞是同种同体、同种异体或异种异体骨髓内皮祖细胞；所述的角膜内皮细胞是同种同体、同种异体或异种异体角膜内皮细胞；所述的隔离共培养的骨髓内皮祖细胞和角膜内皮细胞之间是同种同体、同种异体或异种异体。

4.如权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的共培养选自混合共培养或隔离共培养；优选隔离共培养。

5.如权利要求4所述的诱导方法，其特征在于，在隔离共培养的第三天再加入角膜内皮细胞培养上清液和新鲜培养液，间隔两天后再通过半量换液法加入角膜内皮细胞培养上清液和新鲜培养液；所述的培养液是含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM；所述的角膜内皮细胞培养上清液是为角膜内皮细胞第一代或第二代细胞的培养上清液。

6.一种如权利要求1-5任一所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞的用途，其特征在于，所述的用途是作为种子细胞制备角膜移植物。

7.一种组织工程化角膜后板层，其特征在于，它包括：

(a)药学上可接受的生物可降解材料；和

(b)如权利要求1-5任一所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞；

所述的药学上可接受的生物可降解材料是角膜脱细胞基质(cornea acellularmatrix，CACM)；优选猪角膜脱细胞基质(porcine cornea acellular matrix，PCACM)。

8.如权利要求7所述的角膜后板层，其特征在于，如权利要求1-5任一所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞的含量为1000-4000个细胞/mm²所构建的角膜后板层。

9.一种制备组织工程化角膜后板层的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

(1)将如权利要求1-5任一所述的诱导方法获得的角膜内皮样细胞接种于角膜脱细胞基质(优选猪角膜脱细胞基质)，接种密度为1000-4000个细胞/mm²角膜脱细胞基质；和

(2)培养得到组织工程化角膜后板层。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中加入体积比为1∶1-3的角膜内皮细胞培养上清液和含有1-5％v/v血清的DMEM/F12或DMEM进行培养。