[发明专利]一种获得角膜内皮样细胞的方法及体外构建角膜后板层

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程和眼科领域，尤其涉及获得角膜内皮样细胞的方法及体外构建角膜后板层。

背景技术

角膜内皮细胞通过泵功能和屏障功能，调控了角膜的透明性。成人角膜内皮细胞数随着年龄增加、眼外伤、手术、接触镜佩戴和炎症等因素而下降，但在体内却无法增殖来补偿细胞损失，只能靠细胞体积增大来保持与相邻细胞的紧密对合，阻止房水过多地渗入基质。这是因为前房内生长因子不足，同时房水中又存在生长抑制因子，阻断了细胞的DNA合成，使其停滞在G1期，不能通过有丝分裂来繁殖再生。当角膜内皮细胞密度低于400-700个/mm²时，内皮失代偿，角膜水肿，视力下降或丧失。临床上内皮失代偿疾病如大泡性角膜病变、Fuch’s角膜变性等皆导致角膜内皮病变，角膜混浊和视力下降。治疗角膜内皮功能失代偿的常用手术是穿透性角膜移植。尽管常规的角膜移植已经取得了较大的成功，但仍存在不足之处，包括术后散光，屈光不正，缝线松脱感染，供体来源短缺及术后免疫排斥反应等。角膜虽然处于一个相对免疫赦免的位置，但在无血管的角膜上行角膜移植术仍存在大于10％患者发生排斥反应。1952年Stocker建立了角膜内皮细胞组织培养方法，在此基础上1972年Maurice首次提出了将组织培养的角膜内皮细胞移植到内皮细胞不健康的角膜上的设想，开辟了角膜内皮细胞移植(coneal endothelium transplantation)这一崭新的研究领域。近几年兴起的角膜后弹力层剥除内皮细胞移植术(Descemet stripping endothelialkeratoplasty，DSEK)，利用巩膜隧道小切口，撕去后弹力层和内皮层，再移植异体后板层基质和后弹力层内皮层，无需缝合，相比传统的穿透性角膜移植术，创伤小，免疫排斥进一步降低，术后视力恢复快、散光小，但依然存在供体缺乏、角膜供体老龄化等难题。目前热点研究的体外培养角膜内皮细胞移植也因受到细胞来源不足和无合适的载体而难以应用。因此，寻找种子细胞与合适的生物材料构建组织工程角膜后板层并进行移植是当务之急。

组织工程学(tissue engineering)是一门以细胞生物学和材料学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。组织工程的三大要素包括种子细胞、生物材料及体内微环境。其基本方法是将体外培养扩增的自体正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并可被机体降解吸收的生物支架，植入机体组织缺损部位，在支架材料逐步降解过程中，细胞继续增殖并分泌基质，最终形成相应组织，达到修复组织缺损，重建功能的目的。

目前用于构建组织工程角膜内皮的种子细胞有角膜内皮细胞，内皮前体细胞和骨髓间充质干细胞(MSC)。1979年，Gospodarowicz等将培养的牛角膜内皮细胞接种于猫的角膜片上，体外培养后再移植到内皮受损的猫角膜上，植片保持透明达7天。这一实验开辟了角膜内皮细胞载体培养和移植的新领域。但是内皮细胞来源缺乏，体外虽能扩增，但数量有限。2005年，Mimura等发现角膜内皮周边的细胞增殖能力要明显超过中心的细胞，推测在近角膜缘与小梁组织结构交界处可能存在类似干细胞的角膜内皮前体细胞；又有研究通过周边角膜内皮细胞团块克隆培养方法得到了干细胞样的角膜内皮前体细胞，可以体外成克隆团块样生长增殖，无论在形态上还是增殖力等生物学特性上都具有干细胞的特征，注入前房后能修复兔角膜内皮缺损。但是角膜前体细胞的分离培养非常困难。有学者在成体干细胞MSC的诱导和移植进行了有益的探索。刘小韦等用兔自体BMSCs接种到明胶膜上移植到机械去除角膜内皮细胞的兔角膜内，术后8周水肿逐渐减轻，角膜恢复透明，术后12周逐渐分化为类似多角形的细胞，但是细胞间的间隙较大。MSC到底能否分化为角膜内皮细胞还是未知数，移植后的效果还需长期观察。