[发明专利]萘双加氧酶植物表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于植物遗传育种领域，尤其涉及带有恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)萘双加氧酶基因序列表达载体的构建，更具体的涉及利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将萘双加氧酶基因表达载体转化到植物中，从而促使植物对萘的降解。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)及其衍生物是一类广泛存在于环境中的有机污染物。多环芳烃含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物，可分为芳香稠环和非芳香稠环型，环境污染研究中的多环芳烃一般是指芳香稠环型，其中16种多环芳烃化合物已被美国环保局列入优先控制的污染物黑名单。多环芳烃大多是石油、煤等化石燃料以及木材、 天然气、有机高分子化合物、纸张、作物秸秆和烟草等含碳氢化合物的物质经不完全燃烧或在还原性气氛中经热分解而生成的，PAHs环数相对丰度可以反映来自热解或石油类污染，通常4环及4环以上PAHs主要来源于化石燃料高温燃烧，而2环和3环PAHs则来源于石油类污染。一般而言2-3环的低分子量PAHs具有显著的急性毒性，而某些高分子量的PAHs则具有潜在的致癌性，有很强的致畸、致癌和致突变作用。

近些年，随着我国工业化进程的加快，土壤中多环芳烃(PAHs)的污染程度越来越重，工业发达地区尤为突出。由于土壤有机质对PAHs具有很强的吸附作用，有机质含量高时PAHs易富集，有机质含量与PAHs残留量存在显著相关性。土壤中多环芳烃污染的主要途径有污水灌溉、大气沉降、废物倾倒和工业漏渗。多环芳烃化合物(PAHs)由于水溶性差，辛醇-水分配系数高，常被吸附于土壤颗粒上。因此，该类化合物易于从水中分配到生物体内、沉积层中，土壤就成为PAHs的主要载体。多环芳烃在环境中不断积累，其半衰期从几个月到几年不等。多环芳烃进入土壤后，由土壤表面污染进一步导致下层土壤污染，甚至地下水污染。

治理多环芳烃化合物(PAHs)污染主要有物理修复、化学修复和生物修复。同其它有机污染物相比，多环芳烃化合物在土壤中比较稳定，利用促使其挥发和降解的物理化学方法很难去除，国内外正在筛选高效的吸附剂及臭氧化降解途径。近年来，生物修复技术为PAHs的降解提供了新的途径，生物降解在污染物的迁移转化直至最终消失的过程中占重要地位(Berardez et al Environmental Science & Technology 2004，15：5878-5887)。

生物修复(Bioremediation)的基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用，因此早期的生物修复主要指微生物修复。微生物修复已经发展出一系列技术，如：现场处理、就地处理和生物反应器，其中生物反应器在修复多环芳烃污染的土壤中研究较多。许多细菌、真菌和藻类自身都有一定的降解PAHs的能力，因此在PAHs污染的土壤中，经过自然驯化，可以找到大量的能降解多环芳烃的微生物。近年来人们对降解多环芳烃的微生物进行了广泛的研究，常见微生物有红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、拜叶林克氏菌属(Beijernckia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、蓝细菌(Cyanobacteria)、微球菌属(Micrococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)和弧菌属(Vibrio)等。

由于微生物种类不同以及多环芳烃较难在环境中降解，所以降解PAHs的途径就有较大的差别。微生物产生加氧酶的能力决定了多环芳烃的降解程度。多环芳烃的最初氧化，即苯环加氧是控制PAHs生物降解反应速度的关键步骤。其中，对好氧细菌降解多环芳烃的研究主要集中在假单胞菌的萘降解途径的分析上。以此为例，假单胞菌是通过羟基化作用分解萘，该过程由萘双加氧酶(naphthalene dioxygenase NDO EC：1.14.12.12)系统的参与。目前对该酶的研究结果主要来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)G7菌株，该菌中萘加氧酶(EC：1.14.12.12)系统的三个组分分别是：铁硫黄素蛋白还原酶NahAa(EC：1.14.12.12)、铁氧还蛋白NahAb和加氧酶(EC：1.14.12.12)，加氧酶由大亚基NahAc和小亚基NahAd组成四聚体，电子从NAD(P)H通过铁硫黄素蛋白还原酶和铁氧还蛋白向加氧酶传送，促进加氧酶将两个氧原子加到萘的一个苯环上。