[发明专利]建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法

权利要求书

1、一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步、表达载体pcDNA3.1(-)-APP695的构建：将APP695基因克隆进pcDNA3.1(-)质粒，选择Hind III和Xba I为进行双酶切的工具酶；

第二步、稳定转染：将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法转染进SH-EP1-q7细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；然后用有限稀释法将细胞进行单克隆化；

第三步、稳定转染细胞克隆APP695 mRNA表达的鉴定：用逆转录-聚合酶链反应方法检测APP695 mRNA表达；

第四步、稳定转染细胞克隆APP695和Aβ蛋白表达的鉴定：用Western-blotting检测细胞克隆APP695蛋白表达；用ELISA检测细胞外液中Aβ的表达。

2、根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征是，所述的APP695基因和pcDNA3.1(-)进行Hind III和Xba I双酶切，凝胶回收后用T4 DNA连接酶连接，转化至DH5α感受态细胞，氨苄青霉素抗性筛选重组子pcDNA3.1-APP695，扩增提取质粒，测序鉴定。

3、根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征是，所述的稳定转染，采用脂质体法将载体转染。

4、根据权利要求1或3所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征是，稳定转染后收集单克隆细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，以RNA为模板，APP695引物1和引物2进行PCR。

5、根据权利要求4所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征是，PCE程序具体为：94℃变性3分钟进入循环过程，94℃变性1.5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸4.3分钟，经31个循环后72℃复性10分钟；APP695引物为5’-tctccctgctctacaacgtg-3’和5’-cagccccaaaagaagcc-3’，凝胶电泳鉴定PCR产物。

6、根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征是，第四步中检测细胞克隆APP695，是指：

对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白；

用酶标仪测定蛋白浓度，10μg上样进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜半干电转移，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并且拍照。

7、根据权利要求1所述的建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法，其特征是，第四步中检测Aβ蛋白表达，是指：

用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞；

BCA法测定蛋白浓度，取30.5μg上样进行Tris-tricine电泳，PVDF膜湿转，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。