[发明专利]建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的方法，特别是一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种以进行性痴呆为主要临床表现的神经退行性疾病。阿尔茨海默病的病理生理特征主要包括神经元中的神经纤维缠结、细胞内Aβ产生和神经元外Aβ聚集形成的淀粉样斑块。Aβ由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经过特定的途径加工修饰而成。

烟碱型乙酰胆碱受体为配体门控型离子通道，是由不同基因各自编码的5种不同亚单位(α，β，γ，δ，ε)形成的五聚体结构，在中枢神经系统中最主要表达的有α7和α4β2两种nAChR亚型。神经生物学研究显示，中枢烟碱受体亚型激动可以改善认知功能；在对APP转基因动物的研究中发现长时间经口途径给予尼古丁也可显著降低脑中β淀粉样蛋白量且伴有α7烟碱型乙酰胆碱受体水平上调。在文献The consequences of reducing expression of the alpha7 nicotinic receptor by RNA interference and of stimulating its activitywith an alpha 7 agonist in SH-SY5Y cells indicate that this receptor playsa neuroprotective role in connection with the pathogenesis of Alzheimer’sdisease.Neurochemistry International.51，377-383中作者Qi，X通过RNA干扰的方法观察到经由α7受体亚型所介导的神经保护作用，主要包括可溶性淀粉样前体蛋白的增加和淀粉样蛋白诱导的细胞毒性的降低。这也印证了Marina R.Picciotto等人提出的包括α7在内的中枢烟碱型乙酰胆碱受体对神经退行性疾病可起到一定的神经保护作用，但其具体涉及到的受体亚型和机制并不清楚。因此，建立高通量特异性受体作用的细胞筛选模型用于新药先导化合物筛选，藉此模型进行特定化合物作用类型及效价和效能的研究，利用此细胞模型进行受体信号转导及生物学机制研究等，都是亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种建立神经元烟碱型乙酰胆碱亚型受体细胞模型的方法。本发明在体外模拟阿尔茨海默病的病理特征之一：β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的过度增多，采用脂质体转染的方法，实现了建立人淀粉样前体蛋白和人烟碱型乙酰胆碱受体共表达的细胞模型，对于观察α7烟碱受体亚型的激动对内源性APP加工修饰的影响，从而为筛选具有更高效能的治疗阿尔茨海默病的药物提供了基础。

本发明是通过以下技术方案实现，具体步骤如下：

第一步、表达载体pcDNA3.1(-)-APP695的构建：将APP695基因克隆进pcDNA3.1(-)质粒，选择Hind III和Xba I为进行双酶切的工具酶；

第二步、稳定转染：将pcDNA3.1(-)-APP695用脂质体方法转染进SH-EP1-α7细胞并用筛选抗生素进行加压筛选；然后用有限稀释法将细胞进行单克隆化；

第三步、稳定转染细胞克隆APP695mRNA表达的鉴定：用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测APP695mRNA表达；

第四步、稳定转染细胞克隆APP695和Aβ蛋白表达的鉴定：用Western-blotting检测细胞克隆APP695蛋白表达；用ELISA检测细胞外液中Aβ的表达：

a.检测细胞克隆APP695：

对RT-PCR挑选出的阳性克隆，裂解细胞，提取细胞蛋白；

用酶标仪测定蛋白浓度，10μg上样进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，硝酸纤维素膜半干电转移，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并且拍照。

b.检测Aβ：用含有蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF的裂解液裂解细胞；

BCA法测定蛋白浓度，取30.5μg上样进行Tris-tricine电泳，PVDF膜湿转，一抗室温孵育3h，二抗室温孵育1h，ECL荧光检测，显影定影并拍照。