[发明专利]4连体胸腺素α1基因序列及转基因番茄的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程领域的植物基因序列及转基因的方法，具体地，涉及一种4连体胸腺素α1基因序列及转基因番茄的制备方法。

背景技术

胸腺素α1(Thymosinα1，Tα1)在临床被广泛用于免疫缺陷、病毒感染和自身免疫性疾病治疗，对肝炎(HBV和HCV)、爱滋病(HIV)、癌症(cancer)和糖尿病(diabetes)治疗取得了满意的效果。目前，胸腺素α1生产主要采用组织提取、化学合成和基因工程法。由于组织来源有限和化学合成法的成本高，使胸腺素α1在临床应用受限。利用基因工程法生产胸腺素α1具有潜力，特别是利用植物系统生产胸腺素α1在安全性和降低成本方面均具有明显优势。

经对现有技术文献的检索发现，大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母(Pichia pastoris)是目前基因工程法生产胸腺素α1(Tα1)主要表达系统，如“利用大肠杆菌表达串联胸腺素α1”Chen et al(Biotechnol.Appl.Biochem.，2008，49：51-56)和“构建、表达和鉴定毕赤酵母源的干扰素α2b-胸腺素α1融合蛋白”Yang et al(World J Gastroenterol.，2005，11(17)：2597-602)的研究分别在大肠杆菌和毕赤酵母中成功地表达了人源胸腺素α1。源自大肠杆菌和酵母系统的生物产品需经过纯化加工才能在临床应用，而纯化加工需要必要的设备支撑和昂贵的培养基，使胸腺素α1生产成本提高。同时，加工过程中二次污染和纯化试剂影响胸腺素α1安全性和生物活性的问题难以克服。特别是微生物系统生产的重组蛋白难以去除内毒素污染和酵母系统蛋白修饰的缺陷目前尚无法克服。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种4连体胸腺素α1基因序列及转基因番茄的制备方法。通过构建植物表达载体，在植物中表达有胸腺素α1活性多肽，产品对提高人体免疫力，防止和治疗人类重大疾病如肝炎、艾滋病、癌症和糖尿病方面具有重要应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所涉及的4连体胸腺素α1基因序列，

通过按植物偏爱密码子原则设计合成有胸腺素α1的4×Tα1核苷酸序列，构建植物表达载体，提供了一种按植物偏爱密码子设计合成的DNA分子，该分子包括：编码具有胸腺素α1活性多肽的4×Tα1核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.2中从核苷酸第16-408位的核苷酸序列。

在本发明提供的在植物中表达的胸腺素4×Tα1，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。

在本发明的几种表达载体，它包含上述的DNA分子。

本发明所涉及的利用植物系统表达胸腺素α1功能蛋白的方法，该方法包括如下的步骤：

(1)含目的基因(4×Tα1)表达载体的构建：

将含有4×Tα1基因的克隆载体质粒进行酶切，回收目标DNA片段，获得带有相应的粘性末端的目的基因4×Tα1，然后将其克隆到植物表达载体中，通过测序或酶切鉴定，在确保表达载体中的目的基因阅读框架正确的前提下，再将表达载体质粒用冻融法转入农杆菌中，获得包含目的基因表达载体的工程菌；

(2)植物遗传转化：

①将灭菌后的植物种子播于发苗培养基上，待子叶展开后，将子叶或下胚轴剪成小片作为外植体用于转化；

②将含有目的基因表达载体的工程菌于28℃摇菌培养至OD₆₀₀＝0.8~1.0时，室温6,000g离心5~8min；

③弃上清，菌体用液体MS培养基重悬，然后加入准备好的包括子叶和下胚轴在内的外植体浸泡8~10分钟；

④将浸染结束后的外植体取出，吸去表面残余菌液；然后将外植体置于共培养培养基上在25℃共培养36小时；

⑤共培养结束后将外植体转移到分化培养基上，在25~28℃光照下培养，3~4周可见形成抗性愈伤组织或再生芽；