[发明专利]甲砜基嘧啶类同位素标记试剂、合成方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲砜基嘧啶类稳定同位素标记试剂的设计、合成方法及其在蛋白质比较分析中的应用，特别是结合基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)方法，实现快速、高效、灵敏的差异蛋白质组学分析。

技术背景

蛋白质组学是继基因组学后生命科学领域最具前景的新兴学科之一，其研究最初的目标是找到方法以大规模分离并鉴定蛋白质，摆脱以往只能研究单个或少数蛋白质状态，目前已形成相对成熟的技术和有效的研究手段。随着工作的不断深入，人们已不再满足于对一个混合体系中的蛋白质进行定性分析，要求更加准确的定量分析，其中一项关键内容，就是通过比较正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平的差异，进而找到此环境下密切相关的差异蛋白所引发的疾病，从而为临床诊断、病理研究、新药开发等提供理论依据(参见Biotechnol.Genet.Eng.Rev.1996，13，19-50；Trends Biochem.Sci.2006，31，473-484)。

过去，主要采用二维差异凝胶电泳(DIGE)技术，来实现蛋白质差异表达研究(参见Proteomics 2001，1，377-396)。但是作为分离手段的二维凝胶电泳，有着其固有的缺点，如对于分离强酸性及强碱性蛋白，含量低的蛋白，及某些膜蛋白，结果都不能令人满意，同时这种方法的自动化程度难以提高，再加上其在进行蛋白比较分析方面的局限性(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2000，17，9390-9395；Trends Anal.Chem.2003，22，273-281)，都促使了新方法的发展和应用。

近年来，随着质谱技术的发展，特别是软电离技术-电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)的出现和发展，使得质谱成为蛋白组学研究中日益重要的分析手段。其中，适合于质谱检测的同位素标记方法很令人关注。这种同位素标记方法包括体内和体外标记两种。体内标记是在培养液中引入同位素标记部分(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999，96，6591-6596；Mol.Cell.Proteomics 2002，1，376-386)，其应用范围有限，不能直接对从组织中提取的细胞进行分析；而体外标记中，同位素标记部分是在分析过程中引入，因其应用所受到的限制较少，所以近年来受到重视。其中，最早出现的稳定同位素亲和标记(ICAT)试剂是目前应用最广泛的同位素标记试剂(参见Nat.Biotechnol.1999，10，994-999)，并且已经商品化，蛋白的标记、分离都可以依赖ICAT试剂来实现。然而在实际应用过程中也出现了许多问题，如标签部分质量过大，影响多肽的检测以及增加数据库搜索的复杂性；非特异性吸附、不可逆吸附和容量低等缺陷。此后一系列改良的ICAT试剂和其它类型的标记试剂不断的涌现(参见Nat.Biotechnol.2002，20，512-515；Anal.Chem.2002，74，4969-4979；Mol.Cell.Proteomics 2004，3，1154-1169)，使质谱技术在蛋白质定量研究方面的能力大大提高。然而这些技术依然存在许多不完善之处，比如：同位素标记试剂高昂的成本，标记效率的有限性及后续的分离检测过程引入的定量误差等。

发明内容

本发明要解决的问题是：1)提供一种甲砜基嘧啶类同位素标记试剂；2)提供上述同位素标记试剂中重质试剂的合成方法；3)提供上述同位素标记试剂在蛋白质比较分析中的应用方法。

本发明方法涉及到的这种同位素标记试剂，化学名为[d₀]-/[d₆]-4，6-二甲氧基-2-甲砜基嘧啶(简写为[d₀]-/[d₆]-DMMSP)，其结构如下：

A为甲砜基部分，作为同位素标记的活性部位，用来特异性标记蛋白质或者多肽片段结构中的半胱氨酸残基；

B为嘧啶环部分，作为提高质谱信号的功能部位，用来提高目标多肽或蛋白质的离子化效率，进一步增强质谱响应值；

C为两个甲氧基部分，作为同位素质量标签部位，含有6个氢/氘，用于基于质谱的蛋白质比较分析。

本发明所涉及的重质同位素标记试剂-[d₆]-DMMSP，其合成方法如下式所示：