[发明专利]监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法

权利要求书

1.一种监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步，将指示生物蚯蚓染毒；

第二步，提取第一步得到的蚯蚓体腔细胞；

第三步，收集蚯蚓体腔细胞，作为待测细胞；

第四步，对收集的待测细胞洗涤；

第五步，将洗涤后的待测细胞染色；

第六步，测定细胞的成活率和早期凋亡率；

第七步，根据细胞的成活率和早期凋亡率大小判断土壤重金属和多环芳烃复合污染程度。

2.根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征是，所述蚯蚓为安德爱胜蚓。

3.根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征是，所述提取蚯蚓体腔细胞，是用纤维针结合超声波刺激法提取蚯蚓的体腔细胞，步骤为：①蚯蚓清肠；②将纤维针细管插入蚯蚓体腔；③用超声波仪震荡刺激蚯蚓：④细胞记数和镜检。

4.根据权利要求3所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征是，所述纤维针选用长1cm，内径为0.5mm中空的纤维针细管，所选用的超声波仪频率为28KHz、功率为300W，震荡刺激蚯蚓的时间为2s。

5.根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征是，所述收集蚯蚓体腔细胞，是指：将提取的细胞收集到10mL的离心管中，800×g离心5min，弃去上清液，用缓冲液稀释，调整待测样品细胞数为2×10⁵mL^-1～3×10⁵mL^-1。

6.根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征是，所述待测细胞洗涤，是指：加入2μL胰蛋白酶消化5min，然后用缓冲液洗涤2次，800×g离心5min，再用缓冲液重新悬浮细胞，使细胞的浓度为2×10⁵mL^-1。

7.根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征是，所述待测细胞染色，是指：取195μL细胞悬液，加入5μL Ann-FITC，室温下孵化10min，然后加入10μL PI染液，室温下避光孵育10～15min。

8.根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征是，所述测定细胞的成活率和早期凋亡率，是指：用FACSCalibur型流式细胞仪检测，流式细胞仪氩离子激发光波长为488nm，光源为200mW，用Cellquest9.3版检测每个细胞的前向角散光和侧向光角散光，用波长为520nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于610nm的滤器检测PI。

9.根据权利要求1所述的监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法，其特征是，所述根据蚯蚓体腔细胞的成活率和早期凋亡率大小判断土壤重金属和多环芳烃复合污染程度，其中蚯蚓体腔细胞的成活率越低、早期凋亡率越大，说明该染毒组重金属和多环芳烃复合污染程度越严重。