[发明专利]监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种环保技术领域的土壤污染监测方法，具体是一种监测土壤重金属和多环芳烃复合污染的方法。

背景技术

土壤复合污染是当前进行环境保护科学研究前沿的一个热点，但同时也是研究难点。由于复合污染的复杂性和实验手段的局限性，对污染物复合污染缺少能进行定量表征的实验方法。近年来已相继开展了利用蚯蚓作为载体对可能造成土壤环境污染的化学物质进行测试，并根据这些化学物质对蚯蚓的毒害程度来评价其可能对环境的危害程度。随着生物技术在细胞水平、亚细胞水平和分子水平的发展，对污染物毒性的检测手段也随之得到了提高，流式细胞仪(FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，与传统的荧光镜检查相比，具有高通量、速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。

利用Annexin-V和PI双染色法，用流式细胞仪准确检测出蚯蚓体腔细胞成活率及质膜的早期变化。根据Annexin-V和PI荧光燃料与PS及DNA的结合特性，在流式细胞仪检测的散点图中可以区分出4种类型细胞：A象限内的细胞为死亡晚期细胞，Annexin-V为阴性而PI为阳性(AV^--PI⁺)；B象限内的细胞为坏死细胞，Annexin-V和PI均为阳性(AV⁺-PI⁺)，虽然这类小质膜渗透性受到损伤，但是质膜的完整性还是在一定程度上得到维持；C象限内的细胞为活细胞，Annexin-V和PI均为阴性(AV^--PI^-)，质膜的结构和功能均未发生变化；D象限内的细胞为活细胞，但处于凋亡早期状态，Annexin-V为阳性而PI为阴性(AV⁺-PI^-)这类处于凋亡早期的细胞虽然结构仍然保持着一定的完整性，但是质膜结构受到了一定程度的损伤，是一定量的PS开始由质膜的内侧转移到外侧，质膜的通透性增大，早期凋亡率可以作为污染物毒性评价的敏感指标，用于对污染物毒性的早期预警。

经对现有技术的文献检索发现，PLYTYCZ Barbara等在《European journalof soil biology》(欧洲土壤生物)(2007，43：116-120)上发表的“Flowcytometric measurement of neutral red accumulation in earthwormcoelomocytes：Novel assay for studies on heavy metal exposure”(细胞流式技术检测蚯蚓体腔细胞中性红积累：检测重金属暴露的新方法)，该文中提出细胞流式技术是一种快速检测无脊椎动物体腔细胞中溶酶体中性红积累情况的方法，并依据中性红积累的量来评价环境污染状况。具体方法为：重金属Cu对不同种无脊椎动物的体腔细胞进行体外胁迫，用中性红对体腔细胞染色，利用细胞流式技术检测无脊椎动物体腔细胞中溶酶体中性红积累情况，结果表明无脊椎动物体腔细胞中溶酶体中性红积累的多少可作为Cu污染的生物标志物。其不足在于：该方法局限于体外细胞染毒，以中性红积累作为检测指标，实验周期长，灵敏度较差，不能真实反映指示生物受到污染物胁迫下体腔细胞的损伤情况，因而不适用于对土壤污染的监测和预警。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种以蚯蚓体腔细胞作为标志物的土壤重金属和多环芳烃复合污染预警方法，使其以蚯蚓体腔细胞作为生物标志物对土壤重金属和多环芳烃复合污染进行监测和预警，能对土壤污染检测起到很好的警示作用。

本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：

第一步，将指示生物染毒，按照OECD 207推荐标准方法(1984年，经济合作与发展组织，化学品测试导则207《蚯蚓急性毒性试验》)将安德爱胜蚓(Eisenia andrei)在土壤中染毒。

第二步，提取蚯蚓体腔细胞，用纤维针结合超声波刺激法提取蚯蚓的体腔细胞，步骤为：①蚯蚓清肠；②将纤维针细管插入蚯蚓体腔；③用超声波仪震荡刺激蚯蚓：④细胞记数和镜检。

纤维针选用长1cm，内径为0.5mm中空的纤维针细管，所选用的超声波仪频率为28KHz、功率为300W，震荡刺激蚯蚓的时间为2s。