[发明专利]泌乳素时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及泌乳素(PRL)定量检测试剂盒，属于时间分辨免疫荧光分析法检测领域。

背景技术：

泌乳素(Prolactin，PRL)是一种由垂体前叶分泌的单链多肽激素，由199个氨基酸构成，分子量约为23Kd，其结构和生物学方面与生长激素、胎盘泌乳素属同类激素，男、女性体内均含有。PRL与GH一样不需要通过靶腺发挥作用。它对机体和乳腺的生长发育、乳汁的分泌、性腺发育、调节水及电解质代谢都起着十分重要的作用。泌乳素的合成及释放受神经内分泌控制，主要通过泌乳素释放因子(PRF)和泌乳素抑制因子(PIF)调控(以PIF为主)。女性的泌乳素基础水平较男性的稍高，并在青春期随雌激素的分泌明显升高，在绝经期相应降低。泌乳素的主要功能是刺激乳房发育并维持泌乳，也会抑制性功能。在孕期泌乳素水平逐渐升高至正常值的10-20倍之间，产后3-4周降至非孕期水平，哺乳期妇女维持高泌乳素水平，血清浓度需经几个月才能降至非孕期水平。

目前血清PRL的检测主要有酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受示踪剂性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，此外还有一定的放射性污染。

时间分辨免疫荧光分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)利用具有独特荧光特性的镧系元素，代替酶、同位素等，做为发光免疫分析中的一种重要方法，具有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等许多优点。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用于PRL检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，主要解决现有技术存在的灵敏度低、稳定性差、操作烦琐及污染环境等技术问题。本发明采用铕标记技术，提供铕标记试剂盒，以提高方法的灵敏度及稳定性。

本发明的技术方案是：在进行时间分辨免疫荧光分析检测法前需完成下列准备工作：

首先制备包被板，所用的包被板为特异性抗体包被的板，PRL包被板条的制备包括以下步骤：

(1)将纯化的PRL单克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释，然后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得PRL单克隆抗体包被板条；

(2)将PRL单克隆抗体包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用。其次是PRL铕标记的制备，包括以下步骤：

(1)取待标记抗体加入透析袋中，放入配制好的PH 9.5的碳酸盐缓冲液中，室温透析过夜(其间多次换透析液)；

(2)次日，取出抗体，稀释至0.2-5/mL，按质量比为2∶1的比例(DTTA-Eu：抗体)边振荡边加入DTTA-Eu，室温下在振板机上慢速振荡1小时，然后在黑暗中静置48小时；

(3)标记好的抗体与游离DTTA-Eu通过Sephadex G50(8cm)+Sepharose 6B(38cm)色谱柱(1.5×50cm)分离，分离过程用核酸蛋白仪监控；

(4)用小试管依次分段接受流出物，用分光光度计，在280nm处测吸光度，同时测荧光强度，计算出Eu标抗体浓度；

(5)用0.2um的滤器过滤；

(6)加入0.3％优级纯BSA，2-8℃保存。

泌乳素时间分辨免疫荧光分析法，包括下列步骤：

①固相抗体制备：将抗泌乳素单克隆抗体用碳酸钠缓冲溶液稀释至1-10ug/mL作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；

②镧系元素离子标记抗体制备：选用配对抗泌乳素单克隆抗体用常规方法进行镧系元素离子标记；

③在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入泌乳素标准品或待测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育，最后进行荧光测定。

步骤①中包被液中单克隆抗体的浓度为1-10ug/mL，步骤②中标记抗体用反应缓冲液以体积比为1∶20稀释。步骤②中的镧系元素离子优选为Eu³⁺。步骤③中的反应缓冲液为PH 7.8的50mmol/L Tris-HCl，内含0.9％NaCl，1％BSA，0.05％牛IgG，20uM DTPA，0.08％Tween20和0.1％NaN₃；且该步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。所用增强液为荧光增强液。

泌乳素定量检测试剂盒，其特征是试剂盒包括：包被抗体的缓冲液、封闭液、反应缓冲液、洗液、增强液，以及作为包被抗体的抗泌乳素单克隆抗体，镧系元素离子标记的抗泌乳素单克隆抗体和泌乳素标准品。