[发明专利]一种喜树多倍体的诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种喜树多倍体的诱导方法。 

背景技术

喜树属珙桐科旱莲属植物，是中国特有的经济树种，1998年8月被批准为第一批国家重点II级保护野生植物。喜树中含有的喜树碱具有显著的抗肿瘤活性和独特的抗癌机制。研究证实，喜树碱通过抑制DNA拓扑异构酶I的活性及逆转录病毒的复制来阻止细胞DNA、RNA的合成，是迄今为止发现的唯一专门通过抑制拓扑异构酶I发挥细胞毒性的天然植物活性成分。前期临床试验表明，喜树碱及其衍生物对膀胱癌、脑癌、乳癌、宫颈癌、结肠癌、白血病、肺癌、淋巴癌和肝癌等30余种肿瘤都有不同程度的疗效，从而引起人们的广泛关注，使喜树成为继红豆杉之后又一重要的木本抗癌药用植物。喜树碱是存在于喜树的树皮、根、果实和叶中的具有五元环的生物碱，由于喜树碱是喜树的次生代谢物，因而在喜树中的含量非常低，用常规的从喜树中提取喜树碱的方法会造成喜树植物资源的极大破坏，当采集量超过植物的再生能力时，必然会导致喜树物种的濒危甚至灭绝。随着人们对喜树碱类抗癌药物需求的不断增加，单纯靠从喜树中提取喜树碱的方法已远远不能满足市场的需求。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有喜树中喜树碱含量低的问题，依据植物细胞染色体加倍后，染色体上基因调控有效化学成分的含量往往较正常二倍体高，同时多倍体植物还具有器官巨大性的特征而提供一种喜树多倍体的 诱导方法，该方法可以培育出有效成分(即喜树碱)含量高的喜树四倍体组培苗，从而满足人们对喜树碱类抗癌药物日益增长的需要。 

为达到上述目的，本发明采用的解决方案是：选取喜树的茎或叶作为外植体，并进行消毒处理，将消毒后的外植体接种于愈伤组织培养基中进行培养，再将培养后的愈伤组织置于浓度为100mg/L～500mg/L的秋水仙碱溶液中浸泡12～48小时，然后用无菌水进行冲洗，再转移到不含秋水仙碱的芽分化培养基上暗培养7天后，转入光照培养，待不定芽生长50天后，对其进行多倍体鉴定，选取具有四倍体特征的不定芽转入增殖培养基中产生四倍体丛生芽，再将生长2cm以上的丛生芽分割为单株，转入壮苗培养基中进行培养，然后选择生长健壮的无根苗接种于生根培养基中，培养出喜树四倍体组培苗，当组培苗长至3cm以上时，打开瓶盖，在室内炼苗3～5天，移栽到灭过菌的珍珠岩—田土的基质上； 

所述愈伤组织培养基为：B₅+NAA0～1mg/L+2，4-D0.5～2mg/L+KT0.5mg/L； 

所述芽分化培养基为：MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.2mg/L； 

所述增殖培养基为：MS+NAA0.1～0.5mg/L+6-BA1.0mg/L； 

所述壮苗培养基为：MS+NAA0.05mg/L+6-BA0.3mg/L； 

所述生根培养基为：1/2MS+NAA0.1～0.3mg/L+IBA1.0mg/L； 

上述所有培养基的配制PH均为5.6～6.5，琼脂均为0.7～0.8％，其中愈伤组织培养基、芽分化培养基、增殖培养基和壮苗培养基中蔗糖含量为30g/L，生根培养基中蔗糖含量为15g/L；所有培养基的培养条件为：温度23～27℃、每天光照12小时、光照强度1500～2000Lx。 

上述方案中外植体消毒所采用的消毒液为浓度是70％-75％的酒精和浓度是0.1％的升汞。 

上述方案中多倍体是这样鉴定的：取生长50天后的不定芽于浓度为0.2％的秋水仙素溶液中预处理2.3～2.7小时后，用水冲洗，然后用按3∶1体积比配制的甲醇—冰醋酸固定液固定3.5～4.5小时，接着用纤维素酶和果胶酶各占2.5％的混合酶在25℃恒温箱内处理2.8～3.2小时，倒去酶液，用蒸馏水冲洗2～3次，每次2分钟，去除蒸馏水，制备细胞悬液，并用悬滴法制片，干燥后用改良苯酚品红染色后观察，如染色体数目均为2n＝4x＝88，则确定为四倍体不定芽。 

上述方案中珍珠岩—田土的基质中珍珠岩与田土的配比为3∶7，组培苗移栽至珍珠岩—田土的基质后，应适当遮光，并保持相对湿度在75～85％。 

本发明由于以细胞分裂旺盛的愈伤组织细胞为处理材料进行喜树植物的多倍体诱导，因此获得同源多倍体植株的效率高；又因为喜树多倍体植株的有效成分含量高，因此培育出的喜树具有的喜树碱含量就高，从而可满足人们对喜树碱类抗癌药物的需求。该发明对于喜树植物的改良遗传及保护我国喜树资源具有重要的作用。 

具体实施方式

实施例1