[发明专利]结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒及其制作方法和应用方法

权利要求书

1、本发明涉及结核病和结核分枝杆菌感染者的诊断试剂盒及在结核病和结核杆菌感染者的早期、快速和特异性诊断的应用方法。

2、根据权利要求1所述的建立诊断试剂盒，其原理是利用结核杆菌特异的抗原，刺激受检者的外周血并产生IFN-γ，按照市售的双抗原夹心法人IFN-γELISA检测说明，检测IFN-γ的浓度。因为结核病病人和结核分枝杆菌感染者可产生高水平的IFN-γ，达到对结核病和结核分枝杆菌感染者的诊断目的。

3、根据权利要求2所述建立的诊断试剂盒，其组成的特征在于包括以下组份：

(1)根据权利要求4所述的结核杆菌的特异重组蛋白；

(2)双抗原夹心法人IFN-γELISA检测试剂kit(市售)

4、根据权利要求3所述的一种结核杆菌特异重组蛋白，其特征在于组成该特异重组蛋白的成份包括结核分枝杆菌抗原Rv3875和Rv3874，其核苷酸的序列特征为SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列特征为SEQ.ID.NO.6。

5、如权利要求4所述的抗原，用于机体的细胞免疫应答检测，至少包含以下两种以上的T细胞表位，这些表位在SEQ.ID.NO.6中的位置和特征如下：P.1-16：MTEQQWNFAGIEAAAS；P.9-24：AGIEAAASAIQGNVTS；P.17-32：AIQGNVTSIHSLLDEG；P.57-72：KWDATATELNNALQNL；P.80-95：GQAMASTEGNVTGMFA；P111-129：MAEMKTDAATLAQEAGNF；P123-137：QEAGNFERISGDLKTQ；P165-182：VVRFQEAANKQKQELDEI；P185-202：NIRQAGVQYSRADEEQQQ；P195-210：RADEEQQQALSSQMGF。

6、如权利要求4所述的抗原Rv3875和Rv3874来源的细菌菌种，仅限于结核分枝杆菌的不同型别(人型和牛型)及由这些型别衍生的细菌菌株，以实现结核杆菌特异抗原的目的。

7、如权利要求4所述的结核杆菌特异重组蛋白的构建表达和纯化方法，其特征在于具体步骤如下：首先重组蛋白编码基因通过PCR技术从权利要求3所述的细菌DNA中扩增获得；其次将重组蛋白的编码基因，克隆构建在原核表达质粒中，并将上述质粒转化工程宿主菌大肠杆菌；最后进一步从表达该蛋白的大肠杆菌工程菌中分离纯化该蛋白。

8、如权利要求4所述建立该重组蛋白的工程菌的PCR扩增引物序列包括SEQ.ID.NO.2，SEQ.ID.NO.3，SEQ.ID.NO.4和SEQ.ID.NO.5。

9、根据权利要求1所述的结核病抗原特异的全血IFN-γ诊断试剂盒的应用方法，其特征在于该应用方法包括以下两大阶段：一是抗原特异的IFN-γ释放阶段：包括采集的样本为受检者的外周静脉血；用权利要求4所述的特异重组蛋白刺激外周血细胞，37度培养箱静止培养20-24h；收集培养上清中的血浆。二是抗原特异的IFN-γ检测阶段：按照市售的双抗原夹心法人IFN-γELISA检测试剂kit中的说明，检测上述血浆中IFN-γ的含量。