[发明专利]一种动物源细菌对β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术

权利要求书

1、一种动物源细菌对β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术，含有PCR模板制备试 剂和细菌耐药基因三重PCR扩增试剂，其特征在于：所述PCR模板制备试剂是由洗涤液、 样品处理液组成，所述细菌耐药基因三重PCR扩增试剂包括10倍PCR缓冲液组分为50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl和0.01％明胶，浓度均为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 和dTTP，浓度为25mM/L MgCl₂，三大类耐药基因即CTX-M基因、SHV基因和TEM基因 的特异性上下游引物浓度均为25mmol/L，浓度为5U/UL Taq DNA聚合酶和超纯水。所述动 物源细菌β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR扩增试剂各组分的终浓度如下：1倍PCR缓冲 液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度均为0.25mmol/L，MgCl₂的终浓度为2.5mM/L， β-内酰胺类药物耐药基因CTX-M、SHV、TEM的终浓度分别为0.8mmol/L、0.5mmol/L、 0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶终浓度为0.8U/100UL。

2、根据权利要求1所述的耐药基因三重PCR检测技术，其特征在于：所述样品前处理中只 需离心收集菌体后，经相应处理液处理即可备用。

3、根据权利要求1所述的耐药基因三重PCR检测技术，其特征在于：所述PCR模板制备 试剂洗涤液的成份为：5％的甘油。

4、根据权利要求1所述的耐药基因，其特征在于：所述PCR模板制备试剂样品处理液的成 份为：60％的甘油。

5、根据权利要求1所述的耐药基因三重PCR检测技术，其特征在于：所述的动物源细菌β- 内酰胺类药物耐药基因的三重PCR扩增是将浓度配比适当的三大类β-内酰胺类耐药基因上 下游引物混在一起扩增。

6、根据权利要求1所述的耐药基因三重PCR检测技术，其特征在于：所述三种耐药基因即 CTX-M基因、SHV基因和TEM基因特异性上下游引物序列如下：

CTX-M：

For：5’-AGTGAAAGCGAACCGAATC-3’Rev：5’-CTGTCACCAATGCTTTACC-3’

SHV：

For：5’-ATGCGTATATTCGCCTGTG-3’Rev：5’-CCTCATTCAGTTCCGTTTCC-3’

TEM：

For：5’-CAGAAACGCTGGTGAAAGTA-3’Rev：5’-ACTCCCCGTCGTGTAGATAA-3’

7、一种动物源细菌β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术包括以下步骤：

[1]PCR模板的制备方法如下：

(1)LB培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液、血液或其它体液；

(2)取1ml经LB培养基摇瓶培养4-6h的菌液于无菌1.5mlEP管中，8000-10000rin离心3min， 弃上清，再加入1ml PCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入50-200ul PCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用。

[2]动物源细菌对β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR扩增试剂的配置方法如下：

(1)根据现有技术合成上述耐药基因特异性引物CTX-M、SHV和TEM，用1mmol Tris.Hcl-0.1mmolEDTA缓冲液稀释，使其浓度为25mmol/L；

(2)取10倍的PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物， 浓度为25mM/L MgCl₂，浓度均为25mmol/L三大类耐药基因即CTX-M基因、SHV基因、 TEM基因的特异性上下游引物，浓度为2.5U/UL Taq DNA聚合酶和超纯水装入一无菌的PCR 反应薄壁管中。

[3].动物源细菌β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术中试剂的组成：

(1)取10倍的PCR缓冲液5μl，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合 物4μl，浓度为25mM/L MgCl25μl，浓度为2.5U/UL Taq DNA聚合酶0.8μl，浓度均为 25mmol/L三大类耐药基因即CTX-M基因、SHV基因和TEM基因特异性上下游引物分别0.4 μl、0.25μl、0.125μl于一无菌的PCR反应薄壁管中。

(2)加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可。

[4].PCR扩增循环参数为：

(1)94℃预变性5min；

(2)然后进入循环：94℃变性50s、56℃退火55s、72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃ 延伸5min后，取出于4℃保存。

[5]耐药基因检测结果判定

(1)取5μlPCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V 电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果可见365bp、502bp、719bp的条带， 分别指示CTX-M基因、SHV基因和TEM基因；

(2)直接测序鉴定法：将经过纯化的PCR产物50μl和20μl三基因的上下游引物一起送上海生 工生物有限公司进行DNA测序。