[发明专利]一种动物源细菌对β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术

说明书

[发明领域]

本发明涉及动物源细菌β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术，属于医学分子生 物学领域，具体是关于动物源细菌对β-内酰胺类药物耐药基因三重PCR检测技术方法及 其在耐药性检测中的应用。

[背景技术]

β-内酰胺类药物(β-Iactam antibiotics)是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生 素，根据β-内酰胺环侧链的改变将其分为青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、单环内酰胺 类和非典型β-内酰胺类药物。青霉素(penicillin)于1928年被Fleming发现，并于1939年 被Florey和Chain提纯，随后开始应用于临床，成为临床上使用最早、用量最大的一种抗 生素，开启了一个伟大的抗生素时代。头孢菌素类抗生素于20世纪60年代应用于临床， 具有抗菌作用强、耐青霉素酶、临床疗效高、毒性低、过敏反应较青霉素类少等优点，尤 其是第三代头孢菌素对革兰阴性杆菌的抗菌活性强，为目前应用最广的一类β-内酰胺类药 物。世界卫生组织(WHO)2003年统计数据表明：β-内酰胺类药物的使用量分别占动物源、 人源抗生素使用总量的约30％、40％。我国这一比例更是达到30％-70％。

β-内酰胺类药物主要作用机制是与细菌细胞膜上青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBP)结合，抑制细菌肽聚糖的合成，使细菌无法形成坚韧的细胞壁，导致细菌 死亡；而哺乳动物真核细胞无细胞壁，故不受影响。自β-内酰胺类药物应用于临床伊始， 细菌对该类药物的耐药性便随之产生。90年代以来，几乎所有的β-内酰胺类药物均有相应 的水解酶出现并导致细菌耐药。近年来，β-内酰胺类药物的耐药菌逐渐增多，多重耐药现 象日趋严重，已成为兽医和人医临床抗感染治疗的重要难题。

根据目前研究水平，细菌(尤其是革兰氏阴性杆菌)对β-内酰胺类药物的最主要耐药机 制是产生β-内酰胺酶。近年来，随着β-内酰胺类药物的大量使用，β-内酰胺酶种类也在不 断增加、新β-内酰胺酶亚型也在不断涌现。由B-Iactamases引起的细菌耐药受到了最为广 泛的重视，成为该类药物耐药机理的研究的重点、难点和关注焦点。

根据氨基酸序列的同源性，可将β-内酰胺酶分为不同的基因亚型。世界范围内，不同 地区动物源性细菌产β-内酰胺酶有其地域特征。西班牙动物源性β-内酰胺酶多为TEM-1、 SHV-1(Zarazagaetal，2002)；德国(Guerraetal，2003)、美国(Bradfordetal，1999)和英 国(Ransalletal，2004)情况相似，TEM-1是最常见的动物源性β-内酰胺酶；葡萄牙动物源 性大肠杆菌中检测出TEM-1和SHV(Antunesetal，2004；Ferreiraetal，2002)。CTX-M 型β-内酰胺酶在世界范围内迅速传播，在日本、葡萄牙、西班牙、法国等国均有报道 (Morenoetal，2003；Costaetal，2004；Bonneretal，2004；Matsumotoetal，1988； Teshageretal，2000)。香港从猪、牛及鸽子分离了产CTX-M-23、CTX-M-13、CTX-M-14 或CTX-M-24大肠杆菌。四川大学动物疾病防控生物工程研究中心对我国19个省97个规 模化猪场分离的602株细菌分子流行病学调查发现，我国主要流行TEM、SHV和CTX-M 型。本专利在以上分子流行病学调查的基础上，建立了TEM、SHV和CTX-M型β-内酰胺 酶耐药基因三重PCR检测技术和方法。

目前，细菌耐药性检测技术方法主要有常规药敏试验、抗性蛋白检测技术和耐药性分 子检测技术等。常规药敏试验由于方便、简捷、易判定等优点，尤其是药敏纸片琼脂扩散 法，常用于临床指导用药。但药敏试验是在体外用药物试探性地检验细菌的表型耐药特性， 不能检测细菌潜在的耐药性及耐药基因的来源和传播趋势。抗性蛋白检测法由于操作繁琐， 仪器要求高，不够稳定等原因，一般主要用于对细菌的耐药机理方面的研究。