[发明专利]一种动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR检测技术

权利要求书

1、一种动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR检测技术，含有PCR模板制备试剂 和细菌耐药基因四重PCR扩增试剂，其特征在于：所述PCR模板制备试剂是由洗涤液、样 品处理液组成，所述细菌耐药基因四重PCR扩增试剂包括10倍PCR缓冲液组分为50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl和0.01％明胶，浓度均为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 和dTTP，浓度为25mM/L MgCl₂，四大类耐药基因即aphA3基因、aacC4基因、aadA基 因、aacC2基因的特异性上下游引物浓度均为25mmol/L，浓度为2.5U/μl Taq DNA聚合酶 和超纯水。所述动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR扩增试剂各组分的终浓度 如下：1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度均为0.25mmol/L，MgCl₂的终浓度为2.5mM/L，4类药物耐药基因特异性引物aphA3、aacC4、aadA和aacC2的终 浓度分别为0.125mmol/L、0.2mmol/L、0.45mmol/L和0.225mmol/L，Taq DNA聚合酶终 浓度为1U/50μl。

2、根据权利要求1所述的耐药基因四重PCR检测技术，其特征在于：所述样品前处理中只 需离心收集菌体后，经相应处理液处理即可备用。

3、根据权利要求1所述的耐药基因四重PCR检测技术，其特征在于：所述PCR模板制备 试剂洗涤液的成份为：5％的甘油。

4、根据权利要求1所述的耐药基因四重PCR检测技术，其特征在于：所述PCR模板制备 试剂样品处理液的成份为：60％的甘油。

5、根据权利要求1所述的耐药基因四重PCR检测技术，其特征在于：所述的动物源细菌对 氨基糖苷类药物耐药基因的四重PCR扩增是将浓度配比适当的四大类氨基糖苷类耐药基因 上下游引物混在一起扩增。

6、根据权利要求1所述的耐药基因四重PCR检测技术，其特征在于：所述四种耐药基因即 特异性上下游引物序列如下：

aphA3：

For：5’-TGACTGGGCACAACAGACAA-3’Rev：5’-CGGCGATACCGTAAAGCAC-3’ aacC4：

For：5’-ATGACCTTGCGATGCTCTATGA-3’Rev：5’-CGAATGCCTGGCGTGTTT-3’ aadA：

For：5’-ATCTGGCTATCTTGCTGACA-3’Rev：5’-TATGACGGGCTGATACTGG-3’ aacC2：

For：5’-ACCCTACGAGGAGACTCTGAATG-3’Rev：5’-CCAAGCATCGGCATCTCATA-3’。

7、一种动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR检测技术包括以下步骤：

[1]PCR模板的制备方法如下：

(1)LB培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液、血液或其它体液；

(2)取1ml经LB培养基摇瓶培养4-6h的菌液于无菌1.5mlEP管中，8000-10000rin离心3min， 弃上清，再加入1ml PCR模板制备试剂洗涤液，重复离心一次，弃上清，最后加入50-200ul PCR模板制备试剂样品处理液，震荡混匀后备用。

[2]动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR扩增试剂的配置方法如下：

(1)根据现有技术合成上述耐药基因特异性引物aphA3、aacC4、aadA和aacC2，用1mmol Tris.Hcl-0.1mmolEDTA缓冲液稀释，使其浓度为25mmol/L；

(2)取10倍的PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合物， 浓度为25mM/L MgCl₂，浓度均为25mmol/L四大类耐药基因即aphA3基因、aacC4基因、 aadA基因、aacC2基因的特异性上下游引物，浓度为2.5U/μl Taq DNA聚合酶和超纯水装 入一无菌的PCR反应薄壁管中。

[3]动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR检测技术中试剂的组成：

(1)取10倍的PCR缓冲液5μl，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP混合 物4μl，浓度为25mM/L MgCl₂5μl，浓度为2.5U/μl Taq DNA聚合酶0.4μl，浓度均为25mmol/L 四大类耐药基因即aphA3基因、aacC4基因、aadA基因、aacC2基因的特异性上下游引物 分别0.25μl、0.4μl、0.9μl、0.45μl于一无菌的PCR反应薄壁管中。

(2)加入已制备好的模板5μl，补水至总体积50μl后加入20μl矿物油封顶即可。

[4]PCR扩增循环参数为：

(1)94℃预变性5min；

(2)然后进入循环：94℃变性50s、54℃退火45s、72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃ 延伸5min后，取出于4℃保存。

[5]耐药基因检测结果判定

(1)取5μlPCR产物，与1μl Loading buffer混匀后，点样于2％琼脂糖凝胶电泳板孔中，80V 电压，电泳40min，于紫外荧光成相仪下拍照判定，结果中出现284bp、384bp、486bp、677bp 的条带，则分别指示aadA基因、aacC4基因、aacC2基因、aphA3基因。

(2)直接测序鉴定法：将经过纯化的PCR产物50μl和四种基因的上下游引物各20μl一起送上 海生工生物有限公司进行DNA测序。