[发明专利]一种动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR检测技术

说明书

[发明领域]

本发明涉及动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR检测技术，属于医学分子 生物学领域，具体是关于动物源细菌对氨基糖苷类药物耐药基因四重PCR检测技术及其在 动物源细菌耐药性检测中的应用。

[背景技术]

一、细菌耐药性及其快速检测的重要意义：

我国已成为世界上细菌耐药性最严重的国家之一。细菌的耐药性已经严重危害到了人们 的健康。世界范围内细菌的耐药性也不断加重，人医和兽医临床上甚至出现了无药可治的“超 级耐药菌”，即全耐药细菌(pan-resistance)。因此世界各国和国际组织高度关注动物使用抗菌 药物对食品安全和人类健康的影响。国内外的大量研究资料表明，世界各地细菌检出率及耐 药率都在迅猛增加，耐药性问题变得越来越严重。细菌耐药性的问题已经迫在眉睫，所以全 面开展我国动物源细菌耐药性的调查，建立简单、快速、准确的细菌耐药性检测方法以便进 一步科学的认识和掌握细菌耐药性产生规律、传播机制和作用机理，是摆在我们面前的首要 问题。

随着细菌耐药性的问题不断加剧，药敏试验检测方法和手段变得越来越重要。目前，常 用的药敏试验检测方法主要有两大类：一大类是直接检测细菌对不同抗生素的敏感性，及耐 药表型检测方法，这是目前实验室进行耐药性检测最直接和最常用的方法，但其检出率受测 定方法、孵育温度、时间、培养基的pH及浓度等多种因素的影响较大。因此，必须对其测 定方法学进行严格控制，否则难以获得正确的结果。耐药表型检测方法的另一个缺点就是必 须经过繁琐的细菌分离纯化步骤，检测周期长，不利于指导临床快速准确的用药。常用的耐 药表型检测方法有：(1)纸片扩散法，以测量抑菌直径来判定敏感，中介或耐药，这种方法 兽许多因素的影响，如接种菌量、预孵育时间、抗生素含量及扩散力、平皿厚度等。(2)稀 释法，可测定某种药物对检测菌的最小抑菌浓度(MIC)。其缺点是耗时，费力。(3)E试验， 是1988年由瑞典AB Biodisk公司推出，该方法结合稀释法和扩散法的原理和特点，可直接 测定药物对待测菌的MIC。其缺点是价格昂贵，结果如纸片扩散法一样受多种因素影响。(4) 仪器化和自动化测定，如Vitek系统、MicroScan系统等。通过检测浊度或荧光指示剂的荧 光强度或荧光底物的水解反应判读结果，自动化鉴定仪也具有一定的局限性。首先是自动化 设备费用高昂，仪器设备操作、维护要求高，其次是对于一些生长迟缓的细菌和延迟表达耐 药性诱导酶的细菌，很难在规定的时间内检测出来，往往或造成漏检。同时耐药表型检测方 法是在体外用药物试探性的检验细菌的表型耐药特性，不能检测细菌的隐型耐药性。

另一大类是借助分子生物学等方法检测其耐药基因型，及耐药基因检测方法。这类检测 方法主要有细菌质粒图谱、质粒指纹图谱、质粒消除试验、PCR及PCR-限制性片段长度多 态性(PCR-RFLP)、PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、Southern blot、Dot blot、核酸探 针检测、耐药基因芯片检测、DNA的序列测定等。其中，PCR(包括基于PCR衍生出的其 它方法)和由杂交衍生出的方法应用最多，也最具有前景。

PCR方法具有敏感、特异、快速等优点，可以检测极微量的目的基因进行检测，而不 需要经过费时的细菌分离纯化阶段，能够快速、准确的为临床用药提供有力依据，广泛的应 用于细菌耐药性研究。同时，当耐药表型检测的MIC值处于临界值时，PCR等分子生物学 技术亦能够准确地判定其耐药性。但是，常规的PCR方法并不能满足药敏试验的需要，因 为它一次只能检测出一个耐药基因。常规PCR方法在药敏试验检测上的实用性不高。