[发明专利]测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法

权利要求书

1.测定牛奶、猪肝、鸡肝和动物饲料中盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附 分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)盐酸克伦特罗修饰物的制备

将1～5mg盐酸克伦特罗溶解于0.2～0.6mL水中，缓慢滴加0.1～0.3mL浓 度为10～16.7mg/mL的NaNO₂溶液，用盐酸调节混合液的pH值至1.5，暗处4℃ 反应过夜；取少量上述溶液，滴加到N，N-二甲基苯胺中，溶液颜色由无色变为 淡黄色，表明重氮化反应完成；5～11mg氨基磺酸胺溶解于0.1～0.2mL水中，缓 慢滴加到重氮盐溶液中，终止反应；

(2)免疫原及包被抗原的制备

称取牛血清白蛋白50～100mg和卵清蛋白30～60mg，分别溶解于5mL浓 度为0.01mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲溶液中；将重氮化溶液缓慢滴加至蛋白质溶 液中，加入少量NaOH溶液，使混合液的pH值保持在7.5，搅拌下4℃反应4 小时；将混合物装入透析袋中，透析数天，获得两种盐酸克伦特罗-蛋白质溶液， 冷冻干燥，-20℃保存待用；盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白和盐酸克伦特罗-卵清蛋 白分别用作免疫原及包被抗原；

(3)盐酸克伦特罗多克隆抗体的制备

两种免疫原分别免疫两只兔子：将1～4mg免疫原溶解于0.5～4mL的生理盐 水中，加入0.5～3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸 取0.5～2.0mL乳浊液，多次皮下注射入兔子背部，1～5周后，对兔进行加强免疫， 使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2～5周进行下一 次免疫，并且第三次、第四次免疫后，5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，检测抗体产 生的情况，第五次免疫后，5～15天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过 夜，吸取上层清液，分装，于低温冰箱中储存，有四种抗体，即盐酸克伦特罗- 牛血清白蛋白制备的抗体I，II和盐酸克伦特罗-卵清蛋白制备的抗体III，IV；

(4)建立测定盐酸克伦特罗含量的酶联免疫吸附分析方法

对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定盐酸克伦特罗含量 的ELISA；

(5)ELISA对加标样品中盐酸克伦特罗含量的测定

选择了5种阴性样品：牛奶I，牛奶II，猪肝I、鸡肝I和动物饲料I进行加 标实验，取1～5g样品，加入1～5μL的盐酸克伦特罗储备液，(1)牛奶样品：量 取1～5mL牛奶样品于离心管中，加入纯水稀释1倍，漩涡仪漩涡5分钟，加入 浓度为0.1mol/L盐酸1～5mL，水浴振荡器振荡半小时，静置过夜，次日超声萃 取15分钟，50℃水浴加热，离心，取上层清液待测；(2)肝脏样品：市场购买 的肝脏水洗去血，晾干，取适量肝脏样品切碎，匀浆5分钟，称取1～5g浆状样 品，加入浓度为0.1mol/L稀盐酸1～5mL，水浴振荡器振荡半小时，静置过夜， 次日超声萃取15分钟，离心，取上层清液待测；(3)饲料样品：取饲料样品， 研磨成细粉，称1～5g样品，加入浓度为0.1mol/L稀盐酸1～5mL，水浴振荡器 振荡半小时，次日超声萃取15分钟，离心，取上层清液待测；加标样品萃取液 按1:400～1:1000稀释后用ELISA直接测定，盐酸克伦特罗的加标回收率为 92.2～97.0％，相对标准偏差为1.3～5.3％，说明方法准确性和精密度都比较好；

(6)ELISA和HPLC的比较

盐酸克伦特罗的HPLC条件为：色谱条件：Hypersil Gold柱，柱温为室温， 流动相为甲醇:0.01mol/L NaH₂PO₄水溶液＝35:65，流量1mL/min，进样20μL， 紫外检测波长：240nm，盐酸克伦特罗标准溶液的浓度分别为：0.5、1.0、2.0、 5.0、10.0和20μg/mL，样品萃取液用0.45μm的滤膜过滤后直接测定；

所建立的ELISA的可靠性用HPLC进行进一步验证，5种加标样品，即牛 奶I，加标浓度1μg/mL；牛奶II，加标浓度2μg/mL；猪肝I，加标浓度4μg/g； 鸡肝I，加标浓度5μg/g；动物饲料I，加标浓度3μg/g；加标样品用浓度为0.1mol/L 盐酸萃取并用ELISA和HPLC测定，测定结果以ELISA为横坐标，HPLC为纵 坐标作图得两者的相关曲线，回归方程为Y＝0.992X+0.469，相关系数为0.989， n＝5，说明二者的相关性很好。