[发明专利]从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺

权利要求书

1.一种从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺，其特征在于它是按下 述步骤进行的：

(一)Exendin-4高产工程菌株的构建方法：

(1)经改造得到如SEQ ID No.1所示Exendin-4基因；人工合成Exendin-4基 因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC 3′为正向引物，以 5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3′为反向引物，在SEQ ID No.I所示的 Exendin-4基因5′端加上限制性内切酶Kpn I识别位点；在Kpn I识别位点后添加 编码肠激酶识别位点DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使肠激酶识 别位点的核酸序列与Exendin-4基因紧密相连；在SEQ ID No.I所示的Exendin-4 基因3′端添加两个相连的终止密码子TGATAA和限制性内切酶Nco I识别位点 CCATGG；

(2)克隆载体pMD19-T-Exendin-4的构建：利用PCR扩增步骤(1)所述 的改造后的Exendin-4基因，纯化后与pMD19-T载体连接，构建克隆载体 pMD19-T-Exendin-4；

(3)高效表达载体pET-32a(+)-Exendin-4的构建：用限制性内切酶Kpn  I和Nco I双酶切pMD19-T-Exendin-4质粒，回收目的片断；用限制性内切酶Kpn  I和Nco I消化表达载体质粒pET-32a(+)，回收载体pET-32a(+)大片段，将 二者连接即得到重组Exendin-4表达载体pET-32a(+)-Exendin-4；将表达载体 pET-32a(+)-Exendin-4转化入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到 Exendin-4高产工程菌株BL21(DE3)pLYS-pET-32a(+)-Exendin-4；

(二)从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺：

(1)一个单克隆接种于200ml AMP-LB培养基，25℃过夜静置培养12h； 然后在37℃，220rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀达到0.6后，置于冰上冷却， 加入IPTG至浓度为1mM，在30℃、220rpm条件下诱导6h，收获菌液于- 20℃保存备用；

(2)将步骤(1)保存的菌液于冰上融化后，每克细菌用10ml裂解液悬 浮沉淀，冰浴30min，超声波破碎；所用裂解液的组成为：50mM NaH₂PO4、 500mM NaCl、10mM咪唑、0.01％ Trition 100、2％甘油、10mMβ-巯基乙醇、 0.1％ PMSF、1mM MgCl₂、1U RNase、1U DNase；

(3)将上述裂解液于4℃，8000rpm离心30min；取上清液与Ni-树脂 按2∶1混合，4℃缓慢振荡吸附3h；4℃，3000rpm离心5min，弃去上清；

(4)向步骤(3)的树脂中加入细菌裂解液4倍体积的漂洗缓冲液，4℃ 缓慢振荡30min；4℃，3000rpm离心5min，弃上清；用1倍细菌裂解液体积 的漂洗缓冲液重悬浮树脂，转移到层析柱中；收集漂洗缓冲液最后1.5ml，用 于鉴定洗液中是否还有杂蛋白；漂洗缓冲液组成为：50mM NaH₂PO₄；500mM NaCl；20mM咪唑；pH 8.0；

(5)先用洗脱液I以1.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液I；再用洗脱 液II以1.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液II得到纯化融合蛋白；所用洗脱液 I的组成为：50mM NaH₂PO₄、500mM NaCl、40mM咪唑、2％甘油、10mMβ- 巯基乙醇；所用洗脱液II的组成为：50mM NaH₂PO₄、500mM NaCl、80mM咪 唑、2％甘油、10mMβ-巯基乙醇；所用洗脱液I的体积为11ml，收集6.5ml 后，再分部收集3管，每管1.5ml；所用洗脱液II的体积为9ml，每管1.5ml， 共收集6管；

(6)每3mg重组Exendin-4加入1U肠激酶，4℃消化6h，将酶消化液 与Ni-树脂混合后吸附3h后，过层析柱得到的洗脱液即为纯化的Exendin-4 溶液。