[发明专利]从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及Exendin-4的纯化工艺，具体涉及一种从大肠杆菌中制备纯 化Exendin-4的工艺。

背景技术

利用基因工程方法制备有经济价值的蛋白质成功的关键在于，其一是筛 选高产菌株，其二在于优化纯化方案，提高目的蛋白的纯度和产量。二者缺 一不可。尤其是象Exendin-4，含39个氨基酸残基、分子量仅4.2kD的小蛋 白纯化难度更大。由于其极高的经济价值(7000元/mg，2-型糖尿病治疗的特 效新药)以及将来用于工业化生产，从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工 艺极为重要，因为它决定了Exendin-4的产量、纯度及工业化生产的可行性。 Qiagene及Invitrogen两大国际生物公司建立了从大肠杆菌中制备目的蛋白的 纯化工艺，包括细菌培养、裂解、亲和层析纯化目的蛋白和用肠激酶切除N 端融合肽等，由于该工艺在裂解液配方、洗脱液配方和洗脱方法上还存在不 足，因此用该方法纯化的目的蛋白，尤其是Exendin-4的产量和纯度均不能 令人满意。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种操作工艺简单的 从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺，用该工艺能获得高纯度、高产量 的Exendin-4。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

(一)Exendin-4高产工程菌株的构建方法：

(1)经改造得到如SEQ ID No.1所示Exendin-4基因；人工合成Exendin-4基 因，采用PCR方法，以5′GGTACCGACGACGACGACAAGC 3′为正向引物，以 5′CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3′为反向引物，在SEQ ID No.I所示的 Exendin-4基因5′端加上限制性内切酶Kpn I识别位点；在Kpn I识别位点后添加 编码肠激酶识别位点DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使肠激酶识 别位点的核酸序列与Exendin-4基因紧密相连；在SEQ ID No.I所示的Exendin-4 基因3′端添加两个相连的终止密码子TGATAA和限制性内切酶Nco I识别位点 CCATGG；

(2)克隆载体pMD19-T-Exendin-4的构建：利用PCR扩增步骤(1)所述 的改造后的Exendin-4基因，纯化后与pMD19-T载体连接，构建克隆载体 pMD19-T-Exendin-4；

(3)高效表达载体pET-32a(+)-Exendin-4的构建：用限制性内切酶Kpn  I和Nco I双酶切pMD19-T-Exendin-4质粒，回收目的片断；用限制性内切酶Kpn  I和Nco I消化表达载体质粒pET-32a(+)，回收载体pET-32a(+)大片段，将 二者连接即得到重组Exendin-4表达载体pET-32a(+)-Exendin-4；将表达载体 pET-32a(+)-Exendin-4转化入大肠杆菌工程菌BL21(DE3)pLYS中，得到 Exendin-4高产工程菌株BL21(DE3)pLYS-pET-32a(+)-Exendin-4。

(二)从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺：

(1)一个单克隆接种于200ml AMP-LB培养基，25℃过夜静置培养12h； 然后在37℃，220rpm条件下培养至菌液OD₆₀₀达到0.6后，置于冰上冷却， 加入IPTG至浓度为1mM，在30℃、220rpm条件下诱导6h，收获菌液于- 20℃保存备用。

(2)将步骤(1)保存的菌液于冰上融化后，每克细菌用10ml裂解液悬 浮沉淀冰浴30min，超声波破碎；所用裂解液的组成为：50mM NaH₂PO4、 500mM NaCl、10mM咪唑、0.01％Trition 100、2％甘油、10mMβ-巯基乙醇、 0.1％PMSF、1mM MgCl₂、1U RNase、1U DNase。

(3)将上述裂解液于4℃，8000rpm离心30min；将上清液与树脂按2∶1 混合，4℃缓慢振荡吸附3h；4℃，3000rpm离心5min，弃去上清。