[发明专利]一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物以及其应用

(二)背景技术

小麦叶锈病是一种世界性病害，其分布范围比条锈病和秆锈病更广。小麦叶锈病菌适应不同的气候条件，可在全世界不同的小麦种植区发生，若条件适宜可造成40％甚至更大的产量损失(Knott 1989)。在我国，小麦叶锈病过去主要在西南及长江流域的部分地区如贵州、江西等省发生较重，近年来华北、西北及东北各地也日趋严重。在我国1969年、1973年、1975年和1979年曾几度大面积流行，造成严重减产。1998年，小麦叶锈病在全国较大范围内流行，山东鲁西南等地发病严重，后期病叶率达70-80％，严重的达100％，部分田块减产20％以上。利用抗叶锈品种是减轻叶锈病危害的最经济、有效、快捷的方法。目前已有60个抗叶锈病基因正式命名(McIntosh et al.2007)。其中大多数具有生理专化性，这些抗病基因往往会由于病菌小种的变异而很快“丧失”抗性。育种学家和植病学家希望通过利用多基因聚合、基因布局和多系品种来延长苗期抗病基因的抗性寿命。要实现多基因聚合、基因布局和多系品种，必须有丰富的有效抗源，目前已知的有效抗病基因仅有Lr9，Lr19，Lr24和Lr38，因此寻找和发掘新的抗源异常重要。 

目前，在寻找和发掘抗源的过程中，分子标记技术使用较为广泛，特别是在小麦的基因作图中得到了广泛应用。分子标记包括RAPD、RFLP、SSR和RGAP，近年来，利用分子标记定位和标记了多个小麦抗叶锈病基因。其中SSR标记由于其多态性高、共显性、稳定性好及染色体位置清楚而得到了广泛应用，紧密连锁的SSR标记可用于标记辅助选择和聚合育种。在利用分子标记进行抗性筛选和鉴定的过程中，特异性的引物是关键。 

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种用于小麦叶锈病抗性筛选的引物及其应用。 

本发明采用的技术方案如下： 

一种用于筛选小麦叶锈病抗性的引物序列，它包括wmc419和barc181两组引物，其中wmc419的上游引物序列为： 

5′-GTTTCGGATAAAACCGGAGTGC-3′，下游引物序列为： 

5′-ACTACTTGTGGGTTATCACCAGCC-3′；barc181的上游引物序列为： 

5′-CGCTGGAGGGGGTAAGTCATCAC-3′，下游引物序列为： 

5′-CGCAAATCAAGAACACGGGAGAAAGAA-3’。 

如上所述的引物序列是从美国农业部网站公开的多个SSR引物中进行多次试验筛选得到的，在筛选小麦叶锈病抗性方面有很好的应用效果。具体应用为：以待测小麦基因组DNA为模板、wmc419和barc181为引物进行PCR扩增，再对扩增产物进行检测，若扩增产物中含有153bp和165bp大小的条带，则待测小麦有叶锈病抗性。 

本发明所提供的用于筛选抗叶锈病小麦的分子标记分别是Xwmc419和Xbarc181，标记Xwmc419由引物wmc419扩增获得(153bp)，标记Xbarc181由引物barc181扩增获得(165bp)。 

本发明中具体检测方法如下： 

1)提取待测小麦基因组DNA为模板； 

2)以wmc419和barc181为引物、待测小麦基因组DNA为模板，进行PCR扩增： 

20μL PCR反应体系组成如下： 

待测小麦基因组DNA 20～100ng，Taq酶0.5～1.2U，上下游引物(4μmol·L^-1)各0.5～1.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.2～0.6μL，10×PCR缓冲液2μL，余量为无菌蒸馏水； 

优选组成如下： 

待测小麦基因组DNA60 ng，Taq酶1U，上下游引物(4μmol·L^-1)各1.2μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.4μL，10×PCR缓冲液2μL，余量为无菌蒸馏水。 

PCR反应条件为：94℃预变性4min，随后94℃变性1min，60℃(wmc419)或58℃(barc181)退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；